均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)選酸棗仁抗抑郁有效組分配伍研究＊

趙啟鐸，舒樂(lè)新，高 嵐

(天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193)

酸棗仁Zizyphi Spinosi Semen 為鼠李科植物酸棗Ziziphus jujuba Mill.Var. Spinosa (Bunge) HU ex H.F.Chow 的干燥成熟種子[1]，具有補(bǔ)肝、斂汗、寧心、生津之功效，用于虛煩不眠、體虛多汗、驚悸多夢(mèng)、津傷口渴等證，《本草綱目》將其列為上品。前期研究表明，酸棗仁中抗抑郁作用有效組分為總脂肪油、總黃酮、總皂苷[2-4]。基于中藥復(fù)方協(xié)同作用，本研究中采用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)酸棗仁中3 種抗抑郁作用的主要成分進(jìn)行配伍研究，以篩選出酸棗仁抗抑郁組分的最佳配伍比例?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、試藥與儀器

雄性ICR 小鼠，SPF 級(jí)，體重(20±2)g，購(gòu)于天津市山川紅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科技有限公司，合格證號(hào)為SCXK(津)2009-0001，在飼養(yǎng)環(huán)境下適應(yīng)1 周后使用。室溫為(22±2)℃，相對(duì)濕度為65% ～70%。光照12 h，自由攝食、飲水。

炒酸棗仁(天津中新藥業(yè)集團(tuán)有限公司)，經(jīng)天津中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室張麗娟教授鑒定)，自行提取，分離得到總脂肪油(SY)、總黃酮(SH)、總皂苷(SZ)備用;鹽酸氯米帕明片(北京諾華制藥有限公司，批號(hào)為X0026，規(guī)格為每片25 mg)，用前用2%吐溫-80 水溶液配制成1 g/L，備用。

試驗(yàn)材料懸尾裝置自制，木棒上用木板隔離成4 個(gè)分區(qū)，用膠帶固定鼠尾;強(qiáng)迫游泳所需的2 000 mL 燒杯7 個(gè);BP 211D 型萬(wàn)分之一分析天平(上海君達(dá)儀器廠);秒表(瑞士霍耶爾- 奧利達(dá)斯廠)。

1.2 方法

1.2.1 分組與給藥

將提取的酸棗仁總脂肪油、總黃酮、總皂苷3 種抗抑郁的有效組分作為考察因素，每個(gè)因素各設(shè)7 個(gè)水平(見(jiàn)表1)，按均勻設(shè)計(jì)表U7 ×(76)及其使用表進(jìn)行安排，共得7 種組方，具體配伍見(jiàn)表2。以前期研究[1-3]的有效劑量為依據(jù)，分別確定劑量范圍為總脂肪油10 ～100 mg/kg，總黃酮10 ～100 mg/kg，總皂苷10 ～100 mg/kg。

表1 因素水平表(mg/kg)

表2 灌胃給藥方案(mg/kg)

取ICR 小鼠90 只，隨機(jī)分為9 組，每組10 只，按表2 設(shè)計(jì)的劑量灌胃給藥，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組(KB 組)和鹽酸氯米帕明(25 mg/kg)陽(yáng)性對(duì)照組(YX 組)，給藥體積為10 mL/kg，每日1 次，連續(xù)給藥7 d。

1.2.2 不同配伍的酸棗仁有效組分藥效學(xué)評(píng)價(jià)

小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn):參照文獻(xiàn)[5]。將單個(gè)小鼠放入水深10 cm燒杯(直徑13 cm，高19.5 cm)中，水溫(25 ±2)℃。觀察6 min，記錄后4 min 小鼠游泳的不動(dòng)時(shí)間(指小鼠在水中停止掙扎，或顯漂浮狀態(tài)，僅有微小的肢體運(yùn)動(dòng)以保持頭部浮在水面)。試驗(yàn)結(jié)束將小鼠放在取暖設(shè)備下烘干，放回籠內(nèi)。

小鼠懸尾試驗(yàn):參照文獻(xiàn)[6]。強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)小鼠飼養(yǎng)3 d，每天灌胃給藥1 次，末次給藥后1 h，將單個(gè)小鼠尾端(在距尾2 cm處)用膠布粘在木棒上部，使其成倒掛狀態(tài)，頭部離臺(tái)面15 cm，中間以擋板隔離小鼠視線。小鼠為了克服不正常體位而掙扎活動(dòng)，活動(dòng)一段時(shí)間后出現(xiàn)間斷性不動(dòng)，顯示失望狀態(tài)。觀察6 min，記錄后4 min 內(nèi)小鼠不動(dòng)時(shí)間為失望時(shí)間。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響

結(jié)果見(jiàn)表3 和圖1。

表3 各組小鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾試驗(yàn)結(jié)果(± s，n=10)

表3 各組小鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾試驗(yàn)結(jié)果(± s，n=10)

注:與KB 組比較，＊P ＜0.05，▲P ＜0.01。

組別KB 組A 組B 組C 組D 組E 組F 組H 組YX 組強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間(s)165.1 ±26.9 126.8 ±48.4＊127.9 ±48.4＊127.1 ±41.3＊128.4 ±36.3 129.8 ±36.8 127.4 ±30.4＊123.5 ±38.1＊125.8 ±35.4＊懸尾不動(dòng)時(shí)間(s)106.7 ±29.4 79.5 ±19.4＊78.3 ±27.7＊81.9 ±27.3 77.5 ±27.8▲81.1 ±26.1▲78.5 ±18.3＊75.5 ±31.9＊58.3 ±31.2▲

圖1 酸棗仁有效部位不同配伍對(duì)小鼠強(qiáng)迫游泳和懸尾試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響

2.2 總脂肪油、黃酮及皂苷的最優(yōu)配伍組合

以小鼠強(qiáng)迫游泳不動(dòng)時(shí)間為指標(biāo)，經(jīng)二次多項(xiàng)式逐步回歸法對(duì)小鼠不動(dòng)時(shí)間試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到抗抑郁藥效(Y)與酸棗仁有效組分配伍之間的關(guān)系，方程為 Y1=108 +0.890 X1+0.856 X2-0.249 X3-0.022 1 X1X2(X1為總脂肪油，X2為黃酮，X3為皂苷)，α=0.05，方程調(diào)整后r=0.931 0，F(xiàn)=3.255，P=24.9，回歸方程不顯著。

以小鼠懸尾試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間為指標(biāo)，經(jīng)二次多項(xiàng)式逐步回歸法對(duì)小鼠不動(dòng)時(shí)間試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，得到抗抑郁藥效(Y)與酸棗仁有效組分配伍之間的關(guān)系，方程為Y2=80.3+0.012 6 X1+0.053 5 X2-0.052 1 X3-0.000 621 X1X2，α=0.05，方程調(diào)整后r=0.999 9，F(xiàn)=1 825，P=0.062 2，D- W 統(tǒng)計(jì)量d=0.010 0。回歸方程顯著，此方程中各因素最優(yōu)組合為X1=10 mg/kg，X2=100 mg/kg，X3=10 mg/kg。

2.3 酸棗仁抗抑郁組分配伍方驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果

ICR 小鼠40 只，隨機(jī)分為4 組，各10 只。分別為對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照組[鹽酸氯米帕明(25 mg/kg)]、酸棗仁抗抑郁組分配伍方組(即總脂肪油10 mg/kg+總黃酮100 mg/kg+總皂苷10 mg/kg)和酸棗仁藥材組(生藥794 mg /kg)。連續(xù)給藥7 d，用小鼠懸尾試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間作為藥效學(xué)評(píng)價(jià)指標(biāo)。結(jié)果見(jiàn)表4 和圖2，酸棗仁抗抑郁組分配伍方和藥材組小鼠懸尾試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間與對(duì)照組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。抗抑郁組分配伍方組與酸棗仁藥材組相比，小鼠懸尾試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間縮短，其抗抑郁作用優(yōu)于藥材組，表明該組分配伍方有較好的抗小鼠試驗(yàn)性抑郁作用效果。

表4 酸棗仁抗抑郁組分配伍方對(duì)小鼠懸尾試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響(± s，n=10)

表4 酸棗仁抗抑郁組分配伍方對(duì)小鼠懸尾試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響(± s，n=10)

注:與KB 組比較，＊P ＜0.05。

-25 794(生藥)-空白對(duì)照組(KB)鹽酸氯米帕明組(YX)酸棗仁藥材組(SYC)酸棗仁配伍方組(SKF)117.60±28.53 69.90±25.83＊80.10±33.98＊70.30±22.89＊)-40.6 31.9 40.2

圖2 酸棗仁抗抑郁組分配伍方對(duì)小鼠懸尾試驗(yàn)不動(dòng)時(shí)間的影響

3 討論

本研究所用總脂肪油、總皂苷、總黃酮提取方法是根據(jù)3種有效組分的極性等差異建立的一種系統(tǒng)提取分離法。分別利用石油醚提取法、正丁醇萃取、大孔吸附樹脂分離純化制備各組分。

楊奕等[7]采用均勻設(shè)計(jì)法對(duì)酸棗仁中抗抑郁組分進(jìn)行了配伍研究，以其中的總生物堿、總黃酮、總皂苷作為研究對(duì)象，驗(yàn)證試驗(yàn)表明，最佳配伍為總生物堿17.8 mg/kg+總皂苷113.4 mg/kg。筆者的前期研究結(jié)果表明，酸棗仁中的脂肪油、總黃酮、總皂苷具有明顯的抗抑郁活性，且均不能增加小鼠自主活動(dòng)次數(shù)，可見(jiàn)其抗抑郁作用和增加小鼠自主活動(dòng)無(wú)關(guān)[2-4]，因此采用均勻設(shè)計(jì)方法對(duì)酸棗仁中3 種主要有效組分最佳配伍進(jìn)行研究。相比傳統(tǒng)的正交設(shè)計(jì)法，均勻設(shè)計(jì)在要考察的因素水平較多時(shí)，可減少試驗(yàn)次數(shù)，只需要與因素水平數(shù)相等次數(shù)的試驗(yàn)即可達(dá)到正交設(shè)計(jì)的試驗(yàn)效果[8-11]。

本研究所優(yōu)選的是抗抑郁作用組分配伍關(guān)系。通過(guò)小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)及小鼠懸尾試驗(yàn)，考察小鼠強(qiáng)迫游泳試驗(yàn)及小鼠懸尾試驗(yàn)的不動(dòng)時(shí)間，作為評(píng)價(jià)抗抑郁作用的藥效學(xué)指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)果表明，酸棗仁各有效組分組合均有不同程度的抗抑郁效果。運(yùn)用相關(guān)軟件分析，得出回歸方程，可觀察到各組分對(duì)作用效果的貢獻(xiàn)大小及優(yōu)化用量的信息。統(tǒng)計(jì)分析及驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果證明，總脂肪油、總皂苷、總黃酮是酸棗仁發(fā)揮抗抑郁藥效的有效組分，其組合后的藥效優(yōu)于藥材組，最優(yōu)配伍為總脂肪油10 mg/kg+總黃酮100 mg/kg+總皂苷10 mg/kg。

本研究結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)道的總生物堿17.8 mg /kg +總皂苷113.4 mg /kg 差異很大，可能是由于研究對(duì)象不同，在藥效學(xué)上的反映不同。對(duì)于均勻設(shè)計(jì)法在中藥有效組分配伍的應(yīng)用及酸棗仁抗抑郁組分配伍方發(fā)揮抗抑郁作用的機(jī)理，有待深入研究。

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