喜樹內(nèi)生真菌產(chǎn)喜樹堿菌株的篩選及藥化研究

曹晉靜+康冀川

摘要：采用PDA培養(yǎng)基對151株喜樹內(nèi)生真菌進(jìn)行發(fā)酵，未篩選出產(chǎn)喜樹堿及其類似物的內(nèi)生真菌，而采用喜樹種子煎汁作為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，即在PDA培養(yǎng)基中加入了喜樹種子的煎汁，結(jié)果從151株內(nèi)生真菌中共篩選到4株能產(chǎn)生喜樹堿及其類似物的內(nèi)生真菌，其中產(chǎn)喜樹堿的3株，產(chǎn)10-羥基喜樹堿的1株。試驗(yàn)篩選出了能產(chǎn)喜樹堿及其類似物的內(nèi)生真菌。

關(guān)鍵詞：喜樹；喜樹堿；內(nèi)生真菌

中圖分類號：S567 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）03-0565-04

喜樹 （Camptothecaa cuminata Decne.）又名旱蓮木、千仗樹，屬珙桐科（藍(lán)果樹科、紫樹科）（Nyssaceae）喜樹屬（Camptotheca Decne.），多年生亞熱帶落葉闊葉樹，是我國特有的樹種，在我國的分布較為廣闊，南至云南的西雙版納，北至山西秦嶺地區(qū)[1]。喜樹中含有多種有活性的化合物，如喜樹堿、喜樹次堿，10-羥基喜樹堿等。研究表明，喜樹堿及其衍生物具有顯著的抗腫瘤活性，現(xiàn)已用于直腸癌及卵巢癌的臨床治療[2]。從植物內(nèi)生真菌與寄主植物同步演化關(guān)系推測，喜樹內(nèi)生真菌的代謝產(chǎn)物中可能含有喜樹堿及其衍生物[3]。目前對于喜樹的研究主要集中在喜樹堿及其衍生物的提取、純化、檢測等工藝上，而對其內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的研究報(bào)道較少。以內(nèi)生真菌與植物的特殊關(guān)系為切入點(diǎn)研究喜樹內(nèi)生真菌與喜樹堿及其衍生物的相關(guān)性，可以為喜樹堿及其衍生物的開發(fā)以及為尋找新型抗癌藥物開辟一條新的道路。

1 材料與方法

1.1 材料及培養(yǎng)基

從喜樹根、莖、葉、果實(shí)中分離得到151株內(nèi)生真菌。

馬鈴薯葡萄糖（PDA）培養(yǎng)基：沸煮后的馬鈴薯汁加葡萄糖20 g，不加瓊脂，滅菌。喜樹種子煎汁培養(yǎng)基：稱取50 g喜樹種子粉碎后煮沸30 min，添加到100 mL PDA培養(yǎng)基中。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 分別精確稱取喜樹堿及10-羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品0.002 5 g，置于25 mL容量瓶中，用甲醇（分析純）溶解，超聲波助溶，最后定容，濃度分別為0.1、0.05 mg/mL。

1.2.2 菌株的發(fā)酵及樣品溶液的制備 采用兩種培養(yǎng)基對待測菌株進(jìn)行液體發(fā)酵，一是PDA培養(yǎng)基，二是喜樹種子煎汁培養(yǎng)基。滅菌后接入一定量的菌絲體， 28 ℃、120 r/min 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)，7 d后將發(fā)酵液用2層紗布過濾得到菌絲球，40 ℃干燥，粉碎。

菌絲體處理方法：稱取1.5～2.0 g粉碎后的菌絲，加入甲醇（分析純）5 mL，超聲波破碎30 min，靜置24 h，取其上清液并用甲醇補(bǔ)足損失的重量，12 000 r/min離心10 min，重復(fù)兩次，0.45 μm纖維慮膜過濾。發(fā)酵液處理方法：將發(fā)酵液裝入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，50 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，加入5 mL甲醇（色譜純）溶解，超聲波30 min助溶，靜置24 h后用0.45 μm油性纖維濾膜過濾2～3次。

1.2.3 HPLC色譜條件 C18柱（直徑15 cm×4 mm ID），檢測波長360 nm，流速0.8 mL/min，柱溫55 ℃，流動(dòng)相甲醇、水體積比為4∶6，進(jìn)樣體積10 μL。

1.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 將喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)液的濃度分別稀釋成0.004、0.005、0.006、0.007、0.008 mg/mL。10-羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)液的濃度稀釋成：0.002 5、0.003 0、0.003 5、0.004 0、0.004 5 mg/mL。按照“1.2.3”的色譜條件進(jìn)樣測定，每個(gè)濃度重復(fù)3次，取峰面積平均值，得出峰面積（y）與濃度（x）的線性回歸方程。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)喜樹堿或10-羥基喜樹堿菌株的初篩結(jié)果

分別對內(nèi)生真菌的發(fā)酵液和菌絲體提取液進(jìn)行處理，采用TLC法初步篩選發(fā)現(xiàn)，用PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的內(nèi)生真菌發(fā)酵液和菌絲體不含喜樹堿或10-羥基喜樹堿；用喜樹種子煎汁培養(yǎng)基培養(yǎng)的內(nèi)生真菌，其發(fā)酵液不含喜樹堿或10-羥基喜樹堿，但在菌絲體提取液中發(fā)現(xiàn)有3株內(nèi)生真菌的檢測斑點(diǎn)與喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品的斑點(diǎn)相對應(yīng)（標(biāo)準(zhǔn)品Rf=0.80，樣品Rf值分別是0.79、0.82、0.82），這3株菌分別是QZ04、CY02和XY09，見圖1；并且還發(fā)現(xiàn)有1株編號為XY05的內(nèi)生真菌的檢測斑點(diǎn)與10-羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品的斑點(diǎn)相對應(yīng)（標(biāo)準(zhǔn)品Rf=0.60，樣品Rf=0.62），見圖2。初步判斷為是產(chǎn)活性產(chǎn)物的菌株，并對其進(jìn)行了形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定，還需用HPLC法再進(jìn)行定性定量的檢測。

2.2 產(chǎn)喜樹堿或10-羥基喜樹堿菌株的定性分析

2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖 標(biāo)準(zhǔn)品的HPLC圖譜見圖3。喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間為12.732 min，峰面積為965.212 mAU；10-羥基喜樹堿標(biāo)品保留時(shí)間為7.293 min，峰面積為1 805.47 mAU。

2.2.2 樣品的HPLC圖 產(chǎn)喜樹堿菌株提取物的HPLC圖譜見圖4。產(chǎn)10-羥基喜樹堿菌株提取物的HPLC圖譜見圖5。

比較標(biāo)準(zhǔn)品與4個(gè)樣品的HPLC檢測峰圖，發(fā)現(xiàn)4個(gè)樣品均有與標(biāo)準(zhǔn)品相似的保留時(shí)間（表1、表2）。綜合試驗(yàn)結(jié)果可以判斷樣品中確實(shí)含有喜樹堿及其類似物。

2.2.3 菌株中喜樹堿、10-羥基喜樹堿的含量測定 通過繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，可以較準(zhǔn)確地計(jì)算出內(nèi)生真菌產(chǎn)喜樹堿或10-羥基喜樹堿的含量。喜樹堿和10-羥基喜樹堿標(biāo)準(zhǔn)曲線分別見圖6、圖7。

建立回歸方程，喜樹堿：y=19 058x-0.4913（r=0.999 8）；10-羥基喜樹堿：y=35 357x+0.144 1（r=0.999 7）。將所測樣品的峰面積代入回歸方程計(jì)算濃度，再換算出QZ04內(nèi)生真菌喜樹堿產(chǎn)量為0.029 mg/g，CY02為0.024 mg/g，XY09為0.037 mg/g；XY05 10-羥基喜樹堿的產(chǎn)量為0.017 mg/g。

3 小結(jié)與討論

1）試驗(yàn)采用TLC法和HPLC法從151株內(nèi)生真菌中共篩選到4株能產(chǎn)生喜樹堿及其類似物的內(nèi)生真菌，其中產(chǎn)喜樹堿的3株，產(chǎn)10-羥基喜樹堿的1株。后經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定[4，5]，這4株菌分別為QZ04（鏈格孢屬，Alternaria sp.）、CY02（擬莖點(diǎn)霉屬，Phomopsis sp.）、XY09（鐮孢屬，F(xiàn)usarium sp.）、XY05（刺盤孢屬，Colletotrichum sp.）。

2）根據(jù)植物內(nèi)生真菌與宿主植物在長期的適應(yīng)進(jìn)化過程中，也可能會使內(nèi)生真菌產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性代謝產(chǎn)物，即共生理論[6]。因此本試驗(yàn)采用了喜樹種子煎汁作為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并作了對照試驗(yàn)，即使用不加誘導(dǎo)物的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未加誘導(dǎo)物發(fā)酵的菌株均不產(chǎn)喜樹堿及其類似物。此外，為進(jìn)一步確定喜樹堿是由內(nèi)生真菌產(chǎn)生而不是來自于種子煎汁，本試驗(yàn)還同時(shí)檢測了種子煎汁PDA培養(yǎng)基中是否含有喜樹堿或10-羥基喜樹堿，結(jié)果未檢測出。表明了這4株喜樹內(nèi)生真菌確實(shí)是在喜樹種子產(chǎn)生的某種前體物質(zhì)刺激下產(chǎn)生了喜樹堿及其類似物。

3）喜樹植株的器官均能產(chǎn)生喜樹堿及其衍生物，然而在葉子和種子中，喜樹堿的含量更高[7]。分離到的這4株產(chǎn)喜樹堿或10-羥基喜樹堿的內(nèi)生真菌有3株來自喜樹葉，1株來自喜樹種子?？赡芤?yàn)槿~子和種子內(nèi)喜樹堿的高含量，才使得該部位的內(nèi)生真菌具有產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力。也可能是因?yàn)槭艿较矘淙~子和種子自身內(nèi)生真菌一些次生代謝的影響，才使得葉子和種子的喜樹堿含量高于其他部位。具體情況有待進(jìn)一步的研究。

4）試驗(yàn)加入了50 g喜樹種子煎汁作為誘導(dǎo)物進(jìn)行發(fā)酵，較劉蘊(yùn)哲[7]的20 g雖有所增多，但活性物質(zhì)的產(chǎn)量卻沒有成線性增長，含量在0.017～0.037 mg/g，不及劉蘊(yùn)哲的0.03～0.04 mg/g，究其原因可能有以下兩點(diǎn)：第一，不同種類的內(nèi)生真菌產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力有所不同，高產(chǎn)菌株還有待進(jìn)一步的篩選；第二，所加入的誘導(dǎo)物太多或太少都不利于內(nèi)生真菌活性產(chǎn)物的產(chǎn)生，有研究報(bào)道指出，喜樹堿在某種程度上也會阻礙自身內(nèi)生真菌的生長[8]。誘導(dǎo)物最適量還有待進(jìn)一步研究。

盡管已分離出了產(chǎn)喜樹堿及其類似物的內(nèi)生真菌，但這些真菌菌絲體提取液中喜樹堿的含量很低，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到大規(guī)模生產(chǎn)的水平，滿足不了商業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此要想投入市場滿足人們的需求還必須通過一系列的手段和途徑來提高內(nèi)生真菌產(chǎn)喜樹堿的產(chǎn)量。目前除了改變培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分，如在發(fā)酵液中添加前體誘導(dǎo)物外，還可尋找一些真菌代謝調(diào)節(jié)劑，抑制其他的次生代謝途徑等。

現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用是提高內(nèi)生真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的一個(gè)有效途徑，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)對內(nèi)生真菌進(jìn)行遺傳改造，通過原生質(zhì)體誘變，遺傳轉(zhuǎn)化，以及基因調(diào)控等分子手段也有望解決內(nèi)生真菌活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低的問題。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李 星.喜樹的分布現(xiàn)狀、藥用價(jià)值及發(fā)展前景[J].陜西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2004（S2）：169-173.

[2] 李立源，張冬艷，白鳳武. 喜樹堿及其衍生物的研究進(jìn)展[J].大連民族學(xué)院學(xué)報(bào)，2001，3（4）：17-22.

[3] 郭良棟.內(nèi)生真菌研究進(jìn)展[J].菌物系統(tǒng)，2001，20（1）：148-152.

[4] 魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1979.

[5] 巴尼特，沈崇堯.半知菌屬圖解[M].第三版.北京：科學(xué)出版社，1977.

[6] 李承森.植物科學(xué)進(jìn)展[M].第二版.北京：高等教育出版社，1999，183-190.

[7] 劉蘊(yùn)哲.喜樹生態(tài)系內(nèi)生真菌的分子鑒定及藥物化學(xué)研究[D].貴陽：貴州大學(xué)，2006.

[8] 劉文哲，張愛新，REINSCHEID U M.喜樹內(nèi)生菌與喜樹堿的關(guān)系[J].西北植物學(xué)報(bào)，2003，23（7）：1275-1278.

3 小結(jié)與討論

1）試驗(yàn)采用TLC法和HPLC法從151株內(nèi)生真菌中共篩選到4株能產(chǎn)生喜樹堿及其類似物的內(nèi)生真菌，其中產(chǎn)喜樹堿的3株，產(chǎn)10-羥基喜樹堿的1株。后經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定[4，5]，這4株菌分別為QZ04（鏈格孢屬，Alternaria sp.）、CY02（擬莖點(diǎn)霉屬，Phomopsis sp.）、XY09（鐮孢屬，F(xiàn)usarium sp.）、XY05（刺盤孢屬，Colletotrichum sp.）。

2）根據(jù)植物內(nèi)生真菌與宿主植物在長期的適應(yīng)進(jìn)化過程中，也可能會使內(nèi)生真菌產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性代謝產(chǎn)物，即共生理論[6]。因此本試驗(yàn)采用了喜樹種子煎汁作為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并作了對照試驗(yàn)，即使用不加誘導(dǎo)物的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未加誘導(dǎo)物發(fā)酵的菌株均不產(chǎn)喜樹堿及其類似物。此外，為進(jìn)一步確定喜樹堿是由內(nèi)生真菌產(chǎn)生而不是來自于種子煎汁，本試驗(yàn)還同時(shí)檢測了種子煎汁PDA培養(yǎng)基中是否含有喜樹堿或10-羥基喜樹堿，結(jié)果未檢測出。表明了這4株喜樹內(nèi)生真菌確實(shí)是在喜樹種子產(chǎn)生的某種前體物質(zhì)刺激下產(chǎn)生了喜樹堿及其類似物。

3）喜樹植株的器官均能產(chǎn)生喜樹堿及其衍生物，然而在葉子和種子中，喜樹堿的含量更高[7]。分離到的這4株產(chǎn)喜樹堿或10-羥基喜樹堿的內(nèi)生真菌有3株來自喜樹葉，1株來自喜樹種子。可能因?yàn)槿~子和種子內(nèi)喜樹堿的高含量，才使得該部位的內(nèi)生真菌具有產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力。也可能是因?yàn)槭艿较矘淙~子和種子自身內(nèi)生真菌一些次生代謝的影響，才使得葉子和種子的喜樹堿含量高于其他部位。具體情況有待進(jìn)一步的研究。

4）試驗(yàn)加入了50 g喜樹種子煎汁作為誘導(dǎo)物進(jìn)行發(fā)酵，較劉蘊(yùn)哲[7]的20 g雖有所增多，但活性物質(zhì)的產(chǎn)量卻沒有成線性增長，含量在0.017～0.037 mg/g，不及劉蘊(yùn)哲的0.03～0.04 mg/g，究其原因可能有以下兩點(diǎn)：第一，不同種類的內(nèi)生真菌產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力有所不同，高產(chǎn)菌株還有待進(jìn)一步的篩選；第二，所加入的誘導(dǎo)物太多或太少都不利于內(nèi)生真菌活性產(chǎn)物的產(chǎn)生，有研究報(bào)道指出，喜樹堿在某種程度上也會阻礙自身內(nèi)生真菌的生長[8]。誘導(dǎo)物最適量還有待進(jìn)一步研究。

盡管已分離出了產(chǎn)喜樹堿及其類似物的內(nèi)生真菌，但這些真菌菌絲體提取液中喜樹堿的含量很低，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到大規(guī)模生產(chǎn)的水平，滿足不了商業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此要想投入市場滿足人們的需求還必須通過一系列的手段和途徑來提高內(nèi)生真菌產(chǎn)喜樹堿的產(chǎn)量。目前除了改變培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分，如在發(fā)酵液中添加前體誘導(dǎo)物外，還可尋找一些真菌代謝調(diào)節(jié)劑，抑制其他的次生代謝途徑等。

現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用是提高內(nèi)生真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的一個(gè)有效途徑，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)對內(nèi)生真菌進(jìn)行遺傳改造，通過原生質(zhì)體誘變，遺傳轉(zhuǎn)化，以及基因調(diào)控等分子手段也有望解決內(nèi)生真菌活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低的問題。

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3 小結(jié)與討論

1）試驗(yàn)采用TLC法和HPLC法從151株內(nèi)生真菌中共篩選到4株能產(chǎn)生喜樹堿及其類似物的內(nèi)生真菌，其中產(chǎn)喜樹堿的3株，產(chǎn)10-羥基喜樹堿的1株。后經(jīng)形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)的鑒定[4，5]，這4株菌分別為QZ04（鏈格孢屬，Alternaria sp.）、CY02（擬莖點(diǎn)霉屬，Phomopsis sp.）、XY09（鐮孢屬，F(xiàn)usarium sp.）、XY05（刺盤孢屬，Colletotrichum sp.）。

2）根據(jù)植物內(nèi)生真菌與宿主植物在長期的適應(yīng)進(jìn)化過程中，也可能會使內(nèi)生真菌產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性代謝產(chǎn)物，即共生理論[6]。因此本試驗(yàn)采用了喜樹種子煎汁作為誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，并作了對照試驗(yàn)，即使用不加誘導(dǎo)物的PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，未加誘導(dǎo)物發(fā)酵的菌株均不產(chǎn)喜樹堿及其類似物。此外，為進(jìn)一步確定喜樹堿是由內(nèi)生真菌產(chǎn)生而不是來自于種子煎汁，本試驗(yàn)還同時(shí)檢測了種子煎汁PDA培養(yǎng)基中是否含有喜樹堿或10-羥基喜樹堿，結(jié)果未檢測出。表明了這4株喜樹內(nèi)生真菌確實(shí)是在喜樹種子產(chǎn)生的某種前體物質(zhì)刺激下產(chǎn)生了喜樹堿及其類似物。

3）喜樹植株的器官均能產(chǎn)生喜樹堿及其衍生物，然而在葉子和種子中，喜樹堿的含量更高[7]。分離到的這4株產(chǎn)喜樹堿或10-羥基喜樹堿的內(nèi)生真菌有3株來自喜樹葉，1株來自喜樹種子?？赡芤?yàn)槿~子和種子內(nèi)喜樹堿的高含量，才使得該部位的內(nèi)生真菌具有產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力。也可能是因?yàn)槭艿较矘淙~子和種子自身內(nèi)生真菌一些次生代謝的影響，才使得葉子和種子的喜樹堿含量高于其他部位。具體情況有待進(jìn)一步的研究。

4）試驗(yàn)加入了50 g喜樹種子煎汁作為誘導(dǎo)物進(jìn)行發(fā)酵，較劉蘊(yùn)哲[7]的20 g雖有所增多，但活性物質(zhì)的產(chǎn)量卻沒有成線性增長，含量在0.017～0.037 mg/g，不及劉蘊(yùn)哲的0.03～0.04 mg/g，究其原因可能有以下兩點(diǎn)：第一，不同種類的內(nèi)生真菌產(chǎn)活性產(chǎn)物的能力有所不同，高產(chǎn)菌株還有待進(jìn)一步的篩選；第二，所加入的誘導(dǎo)物太多或太少都不利于內(nèi)生真菌活性產(chǎn)物的產(chǎn)生，有研究報(bào)道指出，喜樹堿在某種程度上也會阻礙自身內(nèi)生真菌的生長[8]。誘導(dǎo)物最適量還有待進(jìn)一步研究。

盡管已分離出了產(chǎn)喜樹堿及其類似物的內(nèi)生真菌，但這些真菌菌絲體提取液中喜樹堿的含量很低，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到大規(guī)模生產(chǎn)的水平，滿足不了商業(yè)化生產(chǎn)的要求，因此要想投入市場滿足人們的需求還必須通過一系列的手段和途徑來提高內(nèi)生真菌產(chǎn)喜樹堿的產(chǎn)量。目前除了改變培養(yǎng)液的營養(yǎng)成分，如在發(fā)酵液中添加前體誘導(dǎo)物外，還可尋找一些真菌代謝調(diào)節(jié)劑，抑制其他的次生代謝途徑等。

現(xiàn)代生物技術(shù)的應(yīng)用是提高內(nèi)生真菌活性物質(zhì)產(chǎn)量的一個(gè)有效途徑，利用原生質(zhì)體融合技術(shù)對內(nèi)生真菌進(jìn)行遺傳改造，通過原生質(zhì)體誘變，遺傳轉(zhuǎn)化，以及基因調(diào)控等分子手段也有望解決內(nèi)生真菌活性代謝產(chǎn)物產(chǎn)量低的問題。

參考文獻(xiàn)：

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