Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子與急性移植物抗宿主病關(guān)系的探討

凌艷英，周銘，王阿慧，江雪杰，李慶山*

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院a.檢驗(yàn)科血液室，b.血液科廣東廣州510180；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院血液科廣東廣州510515）

Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子與急性移植物抗宿主病關(guān)系的探討

凌艷英1，a，周銘1，b，王阿慧1，a，江雪杰2，李慶山*1，b

（1.廣州醫(yī)科大學(xué)附屬廣州市第一人民醫(yī)院a.檢驗(yàn)科血液室，b.血液科廣東廣州510180；2.南方醫(yī)科大學(xué)附屬南方醫(yī)院血液科廣東廣州510515）

目的探討異基因造血干細(xì)胞移植治療血液系統(tǒng)疾病后，血清中Th17細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子與急性移植物抗宿主病的關(guān)系。方法78例血液病患者進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植，對(duì)移植后發(fā)生急性移植物抗宿主病患者（n=12），未發(fā)生急性移植物抗宿主病患者（n=14），及健康對(duì)照組（n=10），以及發(fā)生急性移植抗宿主病患者（n=10）在有效治療前后，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測血清中細(xì)胞因子IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ、TGF-β1、IL-22濃度。結(jié)果①aGVHD者（n=12）血清中Th17細(xì)胞相關(guān)因子濃度（pg∕mL）較正常對(duì)照組（n=10）和無aGVHD組（n=14）顯著增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而TGF-β1（1 156.61± 458.04）顯著低于正常對(duì)照組（2 978.34±1 647.71）和無aGVHD組（2 541.62±1 805.16），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。IL-22：未發(fā)生aGVHD組高于健康對(duì)照組（22.14±2.49，19.18±1.24），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；除IL-21、IL-22和IL-23濃度高于健康對(duì)照組外（P＜0.05），其余的細(xì)胞因子健康對(duì)照組和無急性aGVHD組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），aGVHD組血清IL-22濃度與無aGVHD和健康對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。②10例有效治療者，治療后均有降低，治療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而IL-22在有效治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論Th17細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子與（IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ、TGF-β1）與aGVHD的發(fā)生發(fā)展和療效有關(guān)，而與IL-22無關(guān)。

移植物抗宿主病；急性；細(xì)胞因子；Th17細(xì)胞；調(diào)節(jié)性T細(xì)胞

急性移植物抗宿主?。╝cute graft-versus-host diseae，aGVHD）是異基因造血干細(xì)胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，Allo-HSCT）后的主要并發(fā)癥，Allo-HSCT可望治愈腫瘤性或者非腫瘤性血液疾病，但是aGVHD可以引起移植患者早期死亡［1］。以往研究aGVHD的病理生理過程主要集中在Th1和IFN-γ作用介導(dǎo)aGVHD的發(fā)生，然而最近的研究報(bào)道顯示，抑制Th1分化或者中和IFN-γ反而導(dǎo)致更加嚴(yán)重的aGVHD［2-3］，因此，Th1介導(dǎo)的aGVHD理論面臨著挑戰(zhàn)，應(yīng)該還存在一類不同于Th1細(xì)胞的其他新型的Th細(xì)胞在aGVHD中發(fā)揮重要作用。雖然動(dòng)物實(shí)驗(yàn)移植模型中經(jīng)典的理論認(rèn)為aGVHD是Th1細(xì)胞介導(dǎo)的，但是目前認(rèn)為新型的產(chǎn)生特征性細(xì)胞因子IL-17A的T細(xì)胞亞群（Th17細(xì)胞）和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）在aGVHD中發(fā)揮著重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)腎、心實(shí)體器官移植，出現(xiàn)排斥與供體器官中Th1∕17細(xì)胞的富集有關(guān)，異源性抗原或者自身抗原產(chǎn)生的免疫反應(yīng)的類型，與移植器官中Th17、Th1∕17或者Th22產(chǎn)生的細(xì)胞因子有關(guān)［4］，而目前對(duì)于Allo-HSCT后Th1、Th17細(xì)胞重建與移植排斥及aGVHD發(fā)生尚缺乏試驗(yàn)及臨床研究。

因此Th1、Th2、Th17、Tregs間的精密平衡是移植后aGVHD的發(fā)生、嚴(yán)重程度和特定組織損害的重要因子，故筆者擬探討血清中Th17細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子與aGVHD的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 患者一般資料

研究患者來自2010年1月至2013年10月住院的78例各類血液病患者，其中男性45例，女性33例，中位年齡38（11～56）歲。重型再生障礙性貧血（SAA）為初治或者免疫抑制治療無效者，骨髓增生異常綜合征（MDS）為RAEB-2化療后達(dá)到完全緩解（CR），余為RAEBT-1型或者RCMD型初治者，非何杰金氏淋巴瘤（NHL）或者多發(fā)性骨髓瘤（MM）為化療達(dá)到部分緩解（PR）或者CR，慢性粒細(xì)胞白血病病—慢性期（CML-CP）和原發(fā)性骨髓纖維化為初治者，其余急性淋巴細(xì)胞白血?。ˋLL）和急性髓細(xì)胞白血?。ˋML）均為第一個(gè)緩解期（CR1），診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)見文獻(xiàn)［5］。HLA配型采用測序新技術(shù)PCR-SBT（sequencing based typing）或者PCR-SSP（sequence specific primer）方法，HLA-A、B、C、DR、DQ、DP位點(diǎn)高分辨配型。診斷與造血干細(xì)胞來源及配型情況見表1。造血干細(xì)胞來源為單純骨髓、單純外周血或者骨髓聯(lián)合外周血。aGVHD：aGVHD的診斷及嚴(yán)重程度根據(jù)國際標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行［6］。

1.2 治療方法

預(yù)處理方案見表1。

表1 78例患者的預(yù)處理方案Tab.1Pretreatment regimen for 78 patients

1.2.1 aGVHD的預(yù)防同胞供者采用CSA聯(lián)合短程MTX的方案：CSA（-3 d起）靜脈滴注維持16h，3mg（∕kg·d），能夠口服時(shí)改口服，移植后100 d內(nèi)維持全血血藥濃度200～400 μg∕L。MTX采用經(jīng)典短程的方案：15 mg∕m2（+1 d、+3 d、+6 d），10 mg∕m（2+11 d）。

血緣關(guān)系半相合及非血緣關(guān)系移植采用上述方案，或者加上酶酚酸酯（驍悉）（mycophenolate mofetil，MMF）0.5 g bid（-1 d～+30 d）。

1.2.2 植入證據(jù)的檢測性染色體、ABO血型、微衛(wèi)星法DNA指紋圖，按照以往的檢測方法，選取微衛(wèi)星DNA位點(diǎn)，采用降落法PCR（TDPCR）擴(kuò)增，80 g∕L聚丙烯酰胺凝膠電泳［7］和高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC），供受者性別不同者采用FISH方法檢測骨髓XX∕XY性染色體的比例。

1.2.3 ELISA法檢測血清細(xì)胞因子抽取正常健康人及患者的外周血2mL，使用血清分離管，凝固至少30 min，然后1 000 g離心10 min。分離血清層保存在-80℃冰箱，檢測時(shí)避免反復(fù)凍融。

血清中細(xì)胞因子IL-17A、IFN-γ、TGF-β、IL-21、IL-23、IL-22試劑盒（購自美國Biolegend公司），操作按照說明書進(jìn)行。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有計(jì)量資料采用均值加減標(biāo)準(zhǔn)差（xˉ±s）表示，兩組間均值比較，先進(jìn)行方差齊性F檢驗(yàn)，若方差齊，采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，方差不齊，改用t′檢驗(yàn)；自身對(duì)照均值比較，采用配對(duì)t檢驗(yàn)；多組間均值的比較，采用單因素方差分析，若方差齊采用F檢驗(yàn)進(jìn)行總體均值比較、SNK法進(jìn)行均值兩兩比較，方差不齊時(shí)采用Welch檢驗(yàn)進(jìn)行總體均值比較、Dunnett T3法進(jìn)行均值兩兩比較。均由SPSS16.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，α=0.05。

2 結(jié)果

采用ELISA法，對(duì)發(fā)生aGVHD患者的血清，進(jìn)行了Th17細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子（IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ、TGF-β1、IL-22）檢測，無aGVHD者和正常者作為對(duì)照組，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（見表2，表3），除IL-22和IL-23無aGVHD組高于健康對(duì)照組外（P＜0.01），其余細(xì)胞因子無aGVHD組與健康對(duì)照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；aGVHD組IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ濃度均高于健康對(duì)照組（P＜0.01）和無aGVHD組（P＜0.05）；aGVHD組與健康對(duì)照組和無aGVHD組比較，血清TGF-β1水平則明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而IL-22在健康對(duì)照組、無aGVHD組和aGVHD組均呈低水平的分泌，雖然無aGVHD組的水平高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），但是aGVHD組與健康對(duì)照組和無aGVHD組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 急性aGVHD患者血清中Th17相關(guān)細(xì)胞因子的濃度Tab.2Concentrations of Th17-associated cytokines in serum for patients with aGVHD（pg∕mL）（ˉ±s）

表2 急性aGVHD患者血清中Th17相關(guān)細(xì)胞因子的濃度Tab.2Concentrations of Th17-associated cytokines in serum for patients with aGVHD（pg∕mL）（ˉ±s）

注：與健康對(duì)照組比較，①P＜0.05，（1）P＜0.01；與無aGVHD組比較，②P＜0.05，（2）P＜0.01。

組別健康對(duì)照無aGVHD aGVHD F∕Welch P n 10 14 12 IL-17 9.85±3.72 10.38±6.62 27.88±10.07⑴⑵22.928 0.000 IL-23 56.34±11.18 88.10±28.37⑴201.67±66.54⑴⑵36.816 0.000 IL-21 123.78±21.19 132.43±48.99⑴278.78±88.68⑴⑵24.438 0.000 IFN-γ 23.42±8.78 21.78±6.93 42.56±22.47①②7.792 0.002 TGF-β1 2 978.34±1 647.71 2 541.62±1 805.16 1156.61±458.04①②4.956 0.013 IL-22 19.18±1.24 22.14±2.49(1)20.15±1.85 76.957 0.003

表3 急性GVHD患者有效治療前后Th17細(xì)胞相關(guān)因子濃度Tab.3Concentrations of Th17-associated cytokines in serum for patients with aGVHD before and after effective treatment（pg∕mL）（ˉ±s）

表3 急性GVHD患者有效治療前后Th17細(xì)胞相關(guān)因子濃度Tab.3Concentrations of Th17-associated cytokines in serum for patients with aGVHD before and after effective treatment（pg∕mL）（ˉ±s）

注：與治療前比較。①P＜0.05，（1）P＜0.01。

組別治療前治療后差值t P IL-17 11.85±3.81 6.48±1.89⑴5.372 00 3.403 0.008 IL-23 46.35±11.11 29.42±7.14⑴16.933 00 4.389 0.002 IL-21 280.20±66.86 148.78±49.28⑴141.417 00 5.034 0.001 IFN-γ 47.46±110.18 36.31±6.66①11.146 00 2.304 0.047 TGF-β1 183.52±29.86 223.32±29.86①39.796 00 3.234 0.010 IL-22 22.61±1.27 25.40±4.41 2.788 00 1.677 0.128

為進(jìn)一步觀察上述細(xì)胞因子和aGVHD的轉(zhuǎn)歸關(guān)系，筆者檢查了10例aGVHD治療有效者在治療前后的細(xì)胞因子變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)（見表2，表3）：IL-17、IL-23、IL-21、IFN-γ細(xì)胞因子濃度有效治療后顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。而TGF-β1明顯回升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），IL-22血清濃度，在有效治療前后均呈現(xiàn)低水平的分泌，治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

Th17細(xì)胞產(chǎn)生特征性的細(xì)胞因子：IL-17（IL-17A）、IL-17F、IL-21和IL-22，Th17細(xì)胞分化需要TGF-β和IL-6，維持Th17表型穩(wěn)定需要IL-23、TNF和IL-1β，然而Th17的擴(kuò)增主要依賴于IL-21。對(duì)于Th17在異基因造血干細(xì)胞移植時(shí)aGVHD發(fā)病中的作用，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ脱芯康贸隽瞬煌慕Y(jié)論，一些資料認(rèn)為Th17起到保護(hù)作用，而一些資料則認(rèn)為其在aGVHD的發(fā)病中起到致病作用［8-10］。在人造血干細(xì)胞移植的回顧性研究中，也存在一些分歧，一些研究發(fā)現(xiàn)在外周血或者發(fā)生aGVHD的組織中Th17細(xì)胞增加［11-12］，而另外的研究則發(fā)現(xiàn)在損害靶器官中是減少的［13］。盡管在鼠模型中Th17細(xì)胞的作用得到了廣泛研究，但是在患者進(jìn)行異基因造血干細(xì)胞移植后，Th17細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)在aGVHD中的作用仍然值得研究。

由于Th17細(xì)胞與Th1和Tregs的發(fā)育相互制約和相互轉(zhuǎn)化［14-15］，在Th1和Th17細(xì)胞共同促進(jìn)aGVHD發(fā)生［16］，故本研究在進(jìn)行Th17相關(guān)細(xì)胞因子檢測的同時(shí)，也對(duì)Th1和Tregs相關(guān)的細(xì)胞因子也進(jìn)行了檢測，包括：IL-17、IL-21、IL-22、INF-γ和TGF-β1。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IL-17、IL-21和IL-23在發(fā)生aGVHD時(shí)顯著高于未發(fā)生aGVHD組和正常對(duì)照組；而其中治療有效的患者在治療緩解后，上述細(xì)胞因子則顯著下降，表明IL-17、IL-21在aGVHD發(fā)病中發(fā)揮作用，而IL-23在維持Th17功能中發(fā)揮作用，進(jìn)一步促進(jìn)了Th17在aGVHD中的致病作用。動(dòng)物研究發(fā)現(xiàn)中和或者阻斷T細(xì)胞的IL-21信號(hào)通路減少了aGVHD發(fā)生［17-18］，試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)阻斷IL-23信號(hào)通路，減輕了結(jié)腸aGVHD的發(fā)生，有效分離aGVHD和移植物抗白血?。╣raft-versus-leukemia，GVL）效應(yīng)，IL-23可能作為治療aGVHD的靶點(diǎn)［19-20］。最近采用的Ustekinumab（結(jié)合于IL-12和IL-23的p40亞單位）能夠成功治療糖皮質(zhì)激素耐藥的aGVHD［21］，均有力支持本研究中細(xì)胞因子動(dòng)態(tài)觀察結(jié)果。

在筆者的研究中，血清中Th1細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IFN-γ在發(fā)生aGVHD組均較無aGVHD組和正常對(duì)照組高，而有效治療后則顯著下降，表明了Th17和Th1細(xì)胞在aGVHD的發(fā)病中協(xié)同作用，YuY等［22］發(fā)現(xiàn)基因修飾T-bet和RORγt的小鼠Th1或者Th17細(xì)胞分化轉(zhuǎn)錄因子不能減輕aGVHD，同時(shí)敲除T-bet和RORγt基因則減輕了aGVHD的發(fā)病，進(jìn)一步證明了Th1和Th17細(xì)胞的協(xié)同作用［23］。但是國內(nèi)王靜等［24］研究發(fā)現(xiàn)，aGVHD患者血漿標(biāo)本中IFN-γ濃度高于正常對(duì)照組和無aGVHD組，在aGVHD有效治療后血漿中濃度有降低但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與本組結(jié)果不同，可能與本組為血清標(biāo)本、aGVHD的嚴(yán)重程度可能不同、以及獲取標(biāo)本的時(shí)間可能有差異等有關(guān)。

在Th1和Th17細(xì)胞的失衡與aGVHD嚴(yán)重程度的關(guān)系研究中，Pan B等［16］在小鼠的模型中發(fā)現(xiàn)外周血中Th1∕Th17細(xì)胞比值的增高，aGVHD的程度加重，可能與Th1細(xì)胞在aGVHD發(fā)病中占據(jù)主導(dǎo)地位有關(guān)［23］，但是目前無臨床相關(guān)報(bào)道。因而將aGVHD歸于Th1或者Th17都是過于簡單化，aGVHD的發(fā)病是Th1和Th17的協(xié)同作用，有待臨床研究證實(shí)。在造血干細(xì)胞移植后，T細(xì)胞免疫重建中存在同時(shí)產(chǎn)生IL-17和IFN-γ的Th1∕17細(xì)胞，“Th1∕17”表型細(xì)胞有向Th1分化的可塑性，有助于Th1反應(yīng)，在aGVHD發(fā)病中Th1細(xì)胞是主要作用，Th17細(xì)胞是次要作用，不排除Th17促進(jìn)aGVHD的發(fā)生，不體現(xiàn)在其數(shù)量上的擴(kuò)增，而是通過向Th1細(xì)胞的分化。

本研究發(fā)現(xiàn)，與IL-17的變化趨勢相反，無aGVHD者血清IL-22水平略高于健康對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但是無aGVHD者和aGVHD患者血清水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，有效治療前后差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，均呈低水平分泌，IL-22主要在Th1和Th17中表達(dá)，最近的一項(xiàng)研究顯示IL-22可以保護(hù)腸道干細(xì)胞免受炎癥介導(dǎo)的組織損傷，從而減輕aGVHD的發(fā)生［25］，在小鼠的移植研究中發(fā)現(xiàn)，IL-22基因敲除的供者T細(xì)胞移植減輕了aGVHD，保留了GVL效應(yīng)［26］，但其在aGVHD發(fā)病中的作用有待進(jìn)一步研究。

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（責(zé)任編輯：陳曠）

Relationship of Cytokines Associated with Th17 Cells and Acute Graft-versus-host Disease

LING Yanying1，a，ZHOU Ming1，b，WANG Ahui1，a，JIANG Xuejie2，LI Qingshan*1，b
（1.a.Clinical Laboratory，b.Department of Hematology，Guangzhou First People′s Hospital，Guangzhou Medical University，Guangzhou 510180，Guangdong，China；2.Department of Hematology，Nanfang Hospital，Southern Medical University，Guangzhou 510515，Guangdong，China）

ObjectiveTo explore the relationship of cytokones associated with Th17 cells in serum and acute graft-versus-host disease from patients with hematologic diseases who were undergone al?logeneic hematopoietic stem cell transplantation.MethodsIn this study，78 patients with haemato?logical diseases were undergone allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.Th17 cell-associ?ated cytokines in serum were examined by enzyme linked immunosorbent assay（ELISA）from pa?tients with acute graft-versus-host disease（aGVHD）（n=12），without aGVHD（n=14），and patientswith aGVHD who were effectively treated（n=10）.Healthy volunteers（n=10）were severed as control.Results①The serum cytokine levels（pg∕mL）of patients with aGVHD（n=12）were signifi?cantly higher compared with healthy control group（n=10）and non-aGVHD group（n=14）（P＜0.05）. On contrary，The TGF-β1 level（pg∕mL）（1 156.61±458.04）was significantly lower than the healthy control group（2 978.34±1 647.71）and non-aGVHD group（2 541.62±1 805.16）（P＜0.05）.IL-22：non-aGVHD group was significantly higher than healthy control group（22.14±2.49，19.18±1.24）（P＜0.05）；IL-21，IL-22，IL-23 were higher than healthy control group（P＜0.05），there was no statistical difference about other cytokines between healthy control group and non-aGVHD group（P＞0.05）.②After treatment，the cytokine levels above in 10 cases of effective treatment decreased to considerable extent，and there was significant difference between before and after effective treatment（P＜0.05），but the IL-22 showed no significant difference between before and after effective treatment（P＞0.05）.ConclusionTh17 cell-associated cytokines（IL-17，IL-23，IL-21，IFN-γ，TGF-β1）in serum are assocoated with pathogenesis，development and treat?ment efficacy of aGVHD，whereas acute GVHD is no relationship with IL-22 cencentration in serum.

graft-versus-host disease；acute；cytokine；Th17 cell；regulatory T cell

R593

A

1673-0143（2014）04-0063-06

2014-06-09

廣東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（S2013010016726）

凌艷英（1977—），女，主管技師，研究方向：血液病形態(tài)學(xué)診斷。

*通訊作者：李慶山（1967—），男，主任醫(yī)師，博士，研究方向：造血干細(xì)胞移植。E-mail：drliqingshang@126.com