WY14643對(duì)高血壓大鼠血管內(nèi)皮的保護(hù)作用

唐 亮，李 健，屈 晨，周月宏，張 曼

WY14643對(duì)高血壓大鼠血管內(nèi)皮的保護(hù)作用

唐 亮1，李 健1，屈 晨1，周月宏2，張 曼1

目的 觀察WY14643對(duì)高血壓大鼠血管內(nèi)皮的作用機(jī)制。方法 通過將38-42周的自發(fā)性高血壓大鼠SHR分離獲取主動(dòng)脈，水浴在10 ml的組織浴槽中。隨機(jī)分為2組，SHR組9只使用蒸餾水處理作為對(duì)照，WY14643組10只使用WY14643進(jìn)行干預(yù)，搜集浴槽中的液體，檢測(cè)血管舒張因子的變化，檢測(cè)血管組織中內(nèi)皮型一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)的改變。結(jié)果 經(jīng)過WY14643處理后，與SHR組相比，WY14643組 NO( 23.4±3.2) μmol/L和PGI2(前列環(huán)素)(413.5±113.6)ng/L的含量明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論 WY14643對(duì)高血壓大鼠血管內(nèi)皮具有保護(hù)作用。

高血壓大鼠SHR；血管舒張因子；一氧化氮合成酶；前列環(huán)素;內(nèi)皮素

近年來，隨著社會(huì)環(huán)境、人口老齡化及生活習(xí)慣的改變，高血壓病的發(fā)生率越來越高，繼而導(dǎo)致各種心腦血管疾病的發(fā)生呈增高趨勢(shì)[1]。研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞在高血壓病的發(fā)生中具有重要作用，血管內(nèi)皮細(xì)胞通過釋放血管內(nèi)皮素，保持其平衡來調(diào)節(jié)血管的收縮節(jié)律。高血壓、糖尿病等病理狀態(tài)下，內(nèi)皮細(xì)胞損傷，使得舒縮因子的平衡被打破，從而導(dǎo)致冠心病等疾病的發(fā)生。Van Bilsen[2]提出衰竭心肌代謝重構(gòu)(metabolic remodeling)的概念后,心肌細(xì)胞糖脂利用和能量代謝紊亂被認(rèn)為參與了冠心病的發(fā)生，過氧化物酶體增殖物激活受體(peroxisome proliferator activated receptor, PPAR)在其中的作用越來越多的被揭示，其廣泛的分布于血管內(nèi)皮及心肌細(xì)胞中，PPAR表達(dá)下降可能是心肌底物和能量代謝紊亂的基礎(chǔ)，有可能是冠心病發(fā)病的機(jī)制[3]。Wy14643是過氧化物酶體增殖物激活受體雙重激動(dòng)藥，它可能對(duì)于內(nèi)皮功能具有保護(hù)作用。本研究使用SHR觀察Wy14643對(duì)血管舒張因子和收縮因子的影響，進(jìn)一步探討其對(duì)高血壓發(fā)生過程中內(nèi)皮功能障礙改善機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 38～42 周的雄性SHR大鼠19只，體重340～380 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，清潔條件下喂食標(biāo)準(zhǔn)飼料，自由飲水，飼養(yǎng)于12 h/12 h明暗交替的環(huán)境中，溫度(21±1)℃。

1.2 試劑 Wy14643(CAS 50892-23-4| 圣克魯斯生物技術(shù)公司)，PGI2 ELISA試劑盒(上?？泼羯锟萍加邢薰?BH4617),EDHFELISA試劑盒(上海藍(lán)基生物科技有限公司，批號(hào)E02E0131), ET-1ELISA試劑盒(上海源葉生物科技有限公司，貨號(hào)：42101)， AngⅡELISA試劑盒(上海武昊經(jīng)貿(mào)有限公司，貨號(hào)：E90005Ra )，NOS羊多克隆抗體(RSm-2118M，Sigma公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及主動(dòng)脈分離 SHR大鼠隨機(jī)分為SHR組(9只)和Wy14643組(10只)，通過腹腔注射10%的水合氯醛進(jìn)行麻醉，0.25 ml/100 g，阻斷血流或離斷血管后10 min內(nèi)將目標(biāo)血管獲得，立即保存在4℃克-林二氏重碳酸鹽緩沖液(pH 7.4)中，NaCl(118 mM),KCl(4.7 mM),MgSO4(2.5 mM),KH2PO4(1.2 mM),CaCl2(2.5 mM),NaHCO3(25 mM) ,葡萄糖(11.1 mM))，加入苯腎上腺素 (1 mM)，刺激血管收縮， Wy14643組使用0.1 nM的Wy14643進(jìn)行處理，處理時(shí)間為20 min，SHR組大鼠使用蒸餾水處理作為對(duì)照。

1.4 NO含量測(cè)定 用LS55熒光分光光度儀測(cè)定已知濃度的N-乙酰半胱氨酸-亞硝基硫醇標(biāo)準(zhǔn)溶液在334/453 nm的熒光強(qiáng)度,制定標(biāo)準(zhǔn)曲線。測(cè)定反應(yīng)體系中加入血管蛋白勻漿前后的熒光強(qiáng)度改變從而計(jì)算NO含量。

1.5 ELISA檢測(cè)PGI2 嚴(yán)格按照各種因子的ELISA試劑盒的說明書進(jìn)行 操作，具體簡(jiǎn)述如下：設(shè)1孔為空白對(duì)照孔( 加100 μl 的蒸餾水)， 設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)孔8孔，將標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋(0、50、10、25、50、100 μmol/L)各100 μl按照次序分別加入空白微孔中(設(shè)立復(fù)孔) ，于空白微孔中依次加入各組樣品血漿100 μl;每孔中加入第一抗體工作液50 μl，充分混勻后將反應(yīng)板密封，室溫置于搖床 3 h，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，每孔加酶標(biāo)抗體工作液(Anti-Rabbit IgG)100 μl，充分混勻?qū)⒎磻?yīng)板密封，置于室溫1 h，用洗滌液將反應(yīng)板充分洗滌4～6次，每孔中加入底物工作液100 μl, 置于37 ℃暗處反應(yīng)30 min，每孔中加入50 μl終止液混勻，用酶標(biāo)儀在450 nm處測(cè)吸光值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計(jì)算數(shù)值[4]。

1.6 Westernblor檢測(cè)eNOS的表達(dá) 取-70 ℃ 保存的血管組織 50 mg 采用RIPA裂解液(碧云天生物公司)提取總蛋白，取樣品10 μl采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定總蛋白濃度，取40 μg總蛋白上樣，經(jīng)12%的分離膠電泳分離蛋白，半干轉(zhuǎn)印至PVDF膜上， 5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，洗膜后分別與抗NOX抗體(1∶600，Sigma )和抗β -actin 的抗體(1∶1000 ，Sigma ) 4 ℃ 雜交過夜，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的對(duì)應(yīng)二抗室溫雜交2 h， ECL化學(xué)發(fā)光系統(tǒng)檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物信號(hào)。 每個(gè)標(biāo)本重復(fù)3次，以β -actin為內(nèi)參進(jìn)行相對(duì)定量分析。

2 結(jié) 果

2.1 WY14643對(duì)高血壓大鼠NO和PGI2的影響 SHR組NO 含量(5.4±1.6) μmol/L, PGI2含量(27.3±5.6) ng/L。 WY14643組經(jīng)過WY14643處理后， NO含量(23.4±3.2)μmol/L、 PGI2含量(413.5±113.6)ng/L。與SHR組相比明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

2.2 WY14643對(duì)高血壓大鼠eNOS的影響 取-70 ℃保存的血管組織，用Westrnblot檢測(cè)兩組血管組織中eNOS的表達(dá)，Westrnblot結(jié)果顯示W(wǎng)Y14643組血管中eNOS(內(nèi)皮型一氧化氮合酶)的蛋白表達(dá)明顯高于SHR組(P<0.05，圖1)。

圖1 WY14643組大鼠的血管中eNOS明顯升高

3 討 論

自從提出衰竭心肌代謝重構(gòu)的概念后，越來越多的證據(jù)支持心肌細(xì)胞糖脂利用和能量代謝紊亂導(dǎo)致心肌重構(gòu)，最終導(dǎo)致充血性心力衰竭(congestive heart failure，CHF)的發(fā)生和發(fā)展。近年來，學(xué)者們逐漸認(rèn)識(shí)到代謝性核受體，尤其是PPAR是正常生理代謝和慢性代謝性疾病發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。代謝性核受體是心肌代謝的節(jié)點(diǎn)，在心肌代謝中尤為重要的是PPAR。許多糖脂代謝酶蛋白均是PPAR的靶基因。CHF患者心肌PPAR表達(dá)下降可能是心肌底物和能量代謝紊亂的基礎(chǔ)。PPAR廣泛存在于血管內(nèi)皮及心肌細(xì)胞中[1]。

CHF患者心肌組織PPAR亞型α的表達(dá)較正常供體心臟組織下降54%。由此推斷PPAR α受損可能參與CHF的發(fā)生發(fā)展,目前菲諾貝特已作為PPAR 亞型α激動(dòng)藥被廣泛臨床應(yīng)用。冠心病、高血壓及慢性心功能不全患者體內(nèi)交感的激活早已成為定論，血和組織兒茶酚胺水平增加將導(dǎo)致脂肪細(xì)胞中三酰甘油分解增加，使得血游離脂肪酸水平增加，成為導(dǎo)致心肌胰島素抵抗的主要機(jī)制。過氧化物酶體增殖物激活受體激動(dòng)劑亞型γ已被廣泛應(yīng)用作為胰島素增敏劑，增加細(xì)胞對(duì)胰島素的利用。

PPAR亞型α和亞型γ的雙重激動(dòng)藥WY14643是通過干預(yù)血管內(nèi)皮收縮因子的釋放來調(diào)節(jié)內(nèi)皮的損傷與修復(fù)[5]。在高血壓狀態(tài)下，大鼠的血管內(nèi)皮釋放出的血管收縮因子，使得疾病進(jìn)一步加重，導(dǎo)致了一個(gè)惡性的循環(huán)模式[6]。血脂及血糖的異常可以引起動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成已被臨床證實(shí)，但PPAR雙重激動(dòng)藥Wy14643除調(diào)整血糖及血脂外對(duì)高血壓的干預(yù)的相關(guān)機(jī)制還不明確。血管內(nèi)皮收縮因子的產(chǎn)生是通過環(huán)氧化酶介導(dǎo)的[7]。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)過WY14643處理后的SHR大鼠血管，NO和PGI2的含量明顯升高，在生理情況下血管內(nèi)皮細(xì)胞可產(chǎn)生血管內(nèi)皮素，如血管收縮因子和舒張因子并保持其平衡，從而可以調(diào)節(jié)血管的收縮與舒張，NO和PGI2經(jīng)過大量研究證明都是血管舒張因子，可以增強(qiáng)血管的舒張功能。尤其是NO可以通過細(xì)胞膜迅速傳遞，并可以達(dá)到血管平滑肌細(xì)胞，使平滑肌松弛，從而動(dòng)脈血管擴(kuò)張，以完成調(diào)節(jié)血壓和血流分布的作用。也有研究證實(shí)，內(nèi)源性NO不僅有血管舒張功能，還能調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮的生長(zhǎng)[8]，觸發(fā)血管活性物質(zhì)的釋放，促進(jìn)血管生長(zhǎng)與再生，對(duì)血管起到保護(hù)作用。本研究還發(fā)現(xiàn)，大鼠血管eNOS(內(nèi)皮型一氧化氮合酶)的表達(dá)也明顯升高，eNOS的升高，促使NO合成的增加，起到血管舒張及血管保護(hù)作用[9]，從而進(jìn)一步印證了WY14643對(duì)血管內(nèi)皮的保護(hù)作用。WY14643通過對(duì)過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)亞型α和亞型γ的作用，促使血管內(nèi)皮產(chǎn)生更多的eNOS，使NO的表達(dá)增加，同時(shí)也使PGI2的含量明顯升高，它們對(duì)血管內(nèi)皮共同起到保護(hù)作用[10]。

綜上所述，應(yīng)用PPAR雙重激動(dòng)藥WY14643能改善血管內(nèi)皮收縮，血管內(nèi)皮收縮是高血壓的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)因素，減少血管內(nèi)皮收縮是降低血壓的方式之一，也表明PPAR雙重激動(dòng)藥WY14643是提高血管內(nèi)皮功能的有效藥物。

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(2013-10-26收稿 2013-12-20修回)

(責(zé)任編輯 郭 青)

Effect of WY14643 on vascular endothelial function in hypertensive rats

TANG Liang1, LI Jian1, QU Chen1, ZHOU Yuehong2, and ZHANG Man1.

1.Department of Cardiology,2. Department of Endocrinology, Central Hospital Attached to Shenyang Medical College, Shenyang 110024,China

Objective To observe the effect of WY14643 on vascular endothelium in rats with hypertension. Methods We selected spontaneous hypertensive rats(SHR) of 38-42 weeks, isolated the aorta and bathed it in 10 ml tissue bath. We randomly divided them into 2 groups: rats of SHR group was just treated with distilled water as control group, 10 rats of WY14643 group was only treated with WY14643 as intervention group.The liquid in bath was collected to detect the changes of vasodilator and eNOS in vascular tissue. Results NO and PGI2(prostacyclin) levels and eNOS(nitric oxide synthase) expression were significantly increased after WY14643 treatment.There was a statistically significant difference (P<0.05) between the two groups. Conclusions WY14643 plays a protective role on vascular endothelium in rats with hypertension.

SHR hypertension rats；vasodilatation factors；nitric oxide synthetase; prostacyclin；endothelin

沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院青年基金支持項(xiàng)目(20122029)

唐 亮，碩士，主治醫(yī)師，E-mail: hannash@eyou.com

120001,沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院:1.循環(huán)科，2.內(nèi)分泌科

R544.1