聯(lián)合使用曲伏前列腺素與毛果蕓香堿對葡萄膜鞏膜房水外流途徑影響的形態(tài)學觀察

張順華，趙家良，劉小力，毛 進，卞愛玲

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院眼科，北京 100730

聯(lián)合使用曲伏前列腺素與毛果蕓香堿對葡萄膜鞏膜房水外流途徑影響的形態(tài)學觀察

張順華，趙家良，劉小力，毛 進，卞愛玲

中國醫(yī)學科學院 北京協(xié)和醫(yī)學院 北京協(xié)和醫(yī)院眼科，北京 100730

目的 通過形態(tài)學觀察的方式探討單獨及聯(lián)合使用前列腺素衍生物曲伏前列腺素與膽堿能藥物毛果蕓香堿對葡萄膜鞏膜房水外流途徑的影響。方法 28只正常無色素兔隨機選取4只為對照組，24只隨機分為毛果蕓香堿組、曲伏前列腺素組和聯(lián)合用藥組，每組8只。對照組在雙眼滴用生理鹽水1 d時以及3個藥物處理組分別在使用2%毛果蕓香堿、0.004%曲伏前列腺素、2%毛果蕓香堿+0.004%曲伏前列腺素后7、14和24 d時各處死無色素兔2只，摘取雙眼眼球，通過HE染色和抗平滑肌抗體染色在光鏡下觀察兔眼睫狀肌縱形肌形態(tài)、肌間隙；對照組在雙眼滴用生理鹽水1 d時以及3個藥物處理組在用藥24 d時各處死無色素兔2只，在電鏡下觀察兔眼睫狀肌細胞及細胞外膠原束的形態(tài)結(jié)構(gòu)。結(jié)果 單獨使用毛果蕓香堿組兔睫狀肌細胞間隙減小，單獨使用曲伏前列腺素組兔睫狀肌細胞間隙增大。聯(lián)合用藥組睫狀肌縱行肌細胞前1/3排列緊密，肌間隙減小，與單獨使用毛果蕓香堿組相似，后2/3肌細胞疏松，肌細胞間隙與單獨使用曲伏前列腺素組相似；聯(lián)合用藥組睫狀肌細胞間膠原的分解情況比單獨用曲伏前列腺素組明顯。結(jié)論 聯(lián)合用藥與單獨使用曲伏前列腺素比較后部睫狀肌間隙無變化，還可能因為增加細胞外膠原分解程度而增加這一途徑的房水外流。

前列腺素類似物；毛果蕓香堿；聯(lián)合用藥；葡萄膜鞏膜途徑

MedJPUMCH,2014,5(1):95-99

前列腺素衍生物具有很強的降眼壓作用，研究表明其和各種降眼壓藥物聯(lián)合使用降眼壓效果均可提高，其中包括膽堿能藥物。前列腺素衍生物通過減少睫狀肌細胞外基質(zhì)、增加睫狀肌間隙而增加葡萄膜鞏膜途徑房水外流來降低眼壓[1- 2]。膽堿能藥物通過收縮睫狀肌牽拉小梁網(wǎng)而增加常規(guī)途徑房水外流，理論上這一過程中睫狀肌細胞間隙會減小，從而減少葡萄膜鞏膜途徑的房水外流[3]。因此從作用機制上分析，這兩類藥物對睫狀肌形態(tài)的改變作用是相反的，即在葡萄膜鞏膜途徑上具有拮抗作用，而一些臨床研究顯示二者聯(lián)合使用可以增加降眼壓的效果[4- 6]，這種理論與實踐不一致的現(xiàn)象表明目前對兩種藥物聯(lián)合使用的機制并不清楚。本研究以正常無色素兔為研究對象，通過觀察0.004%曲伏前列腺素和2%硝酸毛果蕓香堿兩種藥物聯(lián)合使用時睫狀肌縱形肌的形態(tài)改變，探討聯(lián)合用藥對葡萄膜鞏膜途徑的影響。

材料和方法

實驗動物和藥物

動物：健康無色素兔，雌雄不限，體重2.0～2.5 kg，北京協(xié)和醫(yī)院動物實驗室購買及飼養(yǎng)，實驗動物的喂養(yǎng)和使用遵循國家科學技術(shù)委員會頒布的《實驗動物管理條例》。

藥物：0.004%曲伏前列腺素滴眼液(Alcon中國公司)，2%硝酸毛果蕓香堿(永光制藥有限公司)，無菌生理鹽水。

主要試劑和儀器

小鼠單克隆抗平滑肌抗體、與兔平滑肌有交叉免疫反應(yīng)的小鼠抗人平滑肌抗體(DAKO公司)，酶標的抗小鼠免疫球蛋白Envision(DAKO公司)，DAB顯色液(上海寶曼公司)。光學顯微鏡(Olympus-CH，日本)、透射電鏡(日立H- 600,日本)。

用藥方法

取正常無色素兔28只，任選4只作為對照(2只用于光鏡研究，2只用于電鏡研究)，雙眼滴用生理鹽水1 d；其余24只隨機分為毛果蕓香堿組、曲伏前列腺素組和聯(lián)合用藥組，每組8只。毛果蕓香堿組無色素兔每日于9∶00、15∶00、21∶00雙眼各滴毛果蕓香堿一滴，曲伏前列腺素組無色素兔每日于20∶00雙眼各滴曲伏前列腺素一滴，聯(lián)合用藥組無色素兔每日于9∶00、15∶00、21∶00雙眼滴毛果蕓香堿一滴、于20∶00雙眼滴曲伏前列腺素一滴。

形態(tài)學觀察

光鏡標本制作和觀察：將對照組無色素兔2只(4眼)及3個藥物處理組用藥7、14和24 d時無色素兔各2只(4眼)處死，摘取眼球在4%的甲醛固定液中固定2周，與內(nèi)外直肌止端平行處剖開眼球，按常規(guī)方法制作病理切片，選取最大徑線的眼球剖面切片，用HE染色法觀察兔眼各層組織，利用小鼠單克隆抗平滑肌抗體按照常規(guī)方法進行免疫組化染色后，光鏡下觀察睫狀肌縱形肌形態(tài)及肌間隙變化。

電鏡標本制作和觀察：將對照組無色素兔2只(4眼)及3個藥物處理組用藥24 d時無色素兔各2只(4眼)在腹腔注射氯胺酮麻醉下行眼球摘除手術(shù)，眼球摘除后于10 s內(nèi)投入避光保存4%的戊二醛液中，固定30 min，固定后將睫狀肌帶從眼球分離，切取縱行睫狀肌部位制作電鏡標本。隨機選取位點放大6000倍，透射電鏡下觀察睫狀肌細胞微觀結(jié)構(gòu)與細胞間隙，放大12 000倍，透射電鏡下觀察細胞外膠原的變化。

結(jié) 果

抗平滑肌抗體染色結(jié)果

運用單克隆抗平滑肌抗體對兔眼病理切片進行免疫組化染色，可使睫狀肌特異地顯示為棕褐色，從而易于與周圍的組織區(qū)分開，染色后可清楚顯示睫狀肌環(huán)形肌、放射狀肌及縱形肌的形態(tài)和位置，其中縱形肌細胞在睫狀肌中所占比例最大，在葡萄膜鞏膜房水外流通路上起重要作用，是本實驗主要的觀察對象(圖1)。通過對對照組(圖2A)及用藥7、14和24 d的兔眼標本進行抗平滑肌抗體免疫組化染色，發(fā)現(xiàn)隨用藥時間增加，單獨使用毛果蕓香堿組兔睫狀肌收縮，肌細胞間隙減小(圖2B)；單獨使用曲伏前列腺素組睫狀肌縱形肌排列松散且不齊整，肌細胞間隙增大(圖2C)；聯(lián)合用藥組睫狀肌前1/3收縮，肌纖維間隙小，與單獨使用毛果蕓香堿組相似，后2/3肌細胞疏松，肌細胞間隙與單獨使用曲伏前列腺素組相似(圖2D)。

睫狀肌形態(tài)及肌細胞間隙觀察

透射電鏡下(×6000)可以清晰地觀察到單個睫狀肌細胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)以及細胞器的情況。睫狀肌為長梭形或桿形細胞，細胞周圍有一層基底膜樣結(jié)構(gòu)，較易于與其他細胞相區(qū)別。對對照組及不同藥物處理組用藥24 d的兔縱行睫狀肌部位的電鏡標本進行觀察，發(fā)現(xiàn)對照組肌細胞形態(tài)規(guī)則、排列齊整，有正常細胞間隙(圖3A)；毛果蕓香堿組肌細胞纖細、排列緊密，肌細胞間隙明顯變小(圖3B)；曲伏前列腺素組肌細胞形態(tài)欠規(guī)則，肌細胞間隙明顯增大(圖3C)；聯(lián)合用藥組細胞內(nèi)細胞器損傷重，肌細胞纖細、形態(tài)不規(guī)則、排列紊亂，細胞間隙增大(圖3D)。

睫狀肌細胞間膠原束形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察

睫狀肌細胞間隙內(nèi)存在大量細胞外基質(zhì)，通過觀察發(fā)現(xiàn)主要為成束的膠原結(jié)構(gòu)。透射電鏡下(×12 000)可看到膠原束排列整齊，橫切面為圓形或橢圓形，邊界清楚，縱切面為線形，有時可看到深淺交替的明暗帶。對對照組及不同藥物處理組用藥24 d的兔眼睫狀肌標本進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)對照組膠原束排列齊整，膠原無腫脹及融解現(xiàn)象(圖4A)；毛果蕓香堿組膠原束情況與對照組相似(圖4B)；曲伏前列腺素組有膠原束腫脹現(xiàn)象，部分區(qū)域膠原分解溶合呈均質(zhì)狀(圖4C)；聯(lián)合用藥組有膠原束腫脹現(xiàn)象，部分區(qū)域膠原大片分解溶合呈均質(zhì)狀，且比曲伏前列腺素組嚴重(圖4D)。

圖 1 HE染色法和抗平滑肌抗體染色法觀察兔眼睫狀體組織結(jié)構(gòu)(×200)A.HE染色法顯示兔眼睫狀體各層組織，方框顯示睫狀肌縱形肌位置；B.單克隆抗平滑肌抗體染色法示兔眼睫狀體各層組織，睫狀肌特異地顯示為棕褐色，易于與周圍的組織區(qū)分開，可顯示睫狀肌環(huán)形肌(a)、放射狀肌(b)及縱形肌(c)的形態(tài)和位置，方框顯示睫狀肌縱形肌的截取位置和范圍

圖 2 抗平滑肌抗體染色示睫狀肌縱行肌形態(tài)及肌間隙(×200) A.滴用生理鹽水的對照；B.單獨滴用2%毛果蕓香堿24 d；C.單獨滴用0.004%曲伏前列腺素24 d；D.聯(lián)合用藥24 d

圖 3 透射電鏡下睫狀肌形態(tài)及肌細胞間隙(×6000) A.滴用生理鹽水的對照；B.單獨滴用2%毛果蕓香堿24 d；C.單獨滴用0.004%曲伏前列腺素24 d；D.聯(lián)合用藥24 d

圖 4 透射電鏡下睫狀肌細胞間膠原束形態(tài)結(jié)構(gòu)(×12 000) A.滴用生理鹽水的對照；B.單獨滴用2%毛果蕓香堿24 d；C.單獨滴用0.004%曲伏前列腺素24 d；D.聯(lián)合用藥24 d

討 論

睫狀肌是葡萄膜鞏膜房水外流途徑的核心結(jié)構(gòu)，大量研究表明睫狀肌肌細胞間隙和肌細胞間各種細胞外基質(zhì)的改變會直接影響葡萄膜鞏膜途徑的房水外流量[7]，對睫狀肌形態(tài)和主要細胞外基質(zhì)的觀察有助于了解各藥物處理組對葡萄膜鞏膜途徑房水外流的影響。為此，本實驗主要觀察了單獨及聯(lián)合使用0.004%曲伏前列腺素和2%毛果蕓香堿對兔眼睫狀肌形態(tài)結(jié)構(gòu)、肌細胞間隙以及肌細胞外基質(zhì)的影響。

根據(jù)抗平滑肌抗體免疫組化染色結(jié)果，發(fā)現(xiàn)單獨使用0.004%曲伏前列腺素和2%毛果蕓香堿時睫狀肌所發(fā)生的變化與眾多相關(guān)研究的結(jié)論是一致的，即單獨使用前列腺素類似物顯著增加葡萄膜鞏膜途徑房水外流，而單獨使用毛果蕓香堿顯著降低葡萄膜鞏膜途徑房水外流。聯(lián)合用藥組與曲伏前列腺素組比較，葡萄膜鞏膜途徑的阻力并未增加。提示聯(lián)合用藥后睫狀肌的變化并非兩種藥物的簡單疊加，曲伏前列腺素的作用在其中占主導(dǎo)地位。既往研究可能有助于解釋毛果蕓香堿在聯(lián)合用藥中起到的作用。毛果蕓香堿對睫狀肌短時間作用的研究顯示滴用毛果蕓香堿6～8 h后睫狀肌間隙明顯減小，通過此途徑進入睫狀體上腔和脈絡(luò)膜上腔的房水明顯減少[8]；而對睫狀肌的變化深入研究后，發(fā)現(xiàn)睫狀肌的收縮集中在縱形肌細胞的前1/3，后端的睫狀肌因肌細胞收縮變細，肌間隙反而增大[9]；此外低劑量(4%以下)的毛果蕓香堿僅對睫狀肌產(chǎn)生短暫的作用，而且對前列腺素類似物所致睫狀肌舒張產(chǎn)生不完全的拮抗作用[10]。而Yousufzai等[11]研究表明刺激膽堿能受體可產(chǎn)生多種作用，除引起睫狀肌收縮外，還可刺激睫狀肌、睫狀突釋放14-C花生四烯酸和多種內(nèi)源性前列腺素，其中前列腺素E2和前列腺素D2可刺激cAMP生成、抑制三磷酸肌醇產(chǎn)生，并可松弛睫狀肌。這說明擬膽堿能藥物對睫狀肌的作用是雙向的，前者收縮睫狀肌的作用與前列腺素類藥物相拮抗，作用發(fā)生迅速但是相對短暫，后者松弛睫狀肌的作用則可與前列腺素類似物產(chǎn)生協(xié)同效果，理論上作用應(yīng)發(fā)生緩慢但是相對持久。

本研究對對照組及各藥物處理組用藥24 d的標本睫狀肌細胞間主要細胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)進行了電鏡水平的觀察，發(fā)現(xiàn)曲伏前列腺素組和聯(lián)合用藥組均發(fā)生了普遍的膠原溶解現(xiàn)象，這進一步證實曲伏前列腺素可能通過促進基質(zhì)金屬蛋白酶生成、從而導(dǎo)致膠原溶解而增加葡萄膜鞏膜途徑的房水外流這一機制。聯(lián)合用藥組膠原的溶解情況與曲伏前列腺素組比較更為明顯，推測毛果蕓香堿可能增強曲伏前列腺素對膠原溶解的作用，也可能本身產(chǎn)生一定溶解膠原的作用，其具體原因需要進一步實驗研究。

總之，聯(lián)合用藥與單獨使用曲伏前列腺素比較，葡萄膜鞏膜房水外流途徑阻力并未增加，聯(lián)合用藥還可能因為增加細胞外膠原分解程度而增加這一途徑的房水外流。

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Effects of Travoprost, Pilocarpine, and Their Combination on the Morphological Change of Uveoscleral Outflow Pathway in Albino Rabbits

ZHANG Shun-hua, ZHAO Jia-liang, LIU Xiao-li, MAO Jin, BIAN Ai-ling

Department of Ophthalmology, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100730, China

ZHAO Jia-liang Tel: 010-69156358, E-mail:13501132676@163.com

Objective To investigate morphological change of uveoscleral outflow pathway after travoprost and pilocarpine are given alone or in combination. Methods Of 28 normal albino rabbits，4 were randomly selected as the control group (treated with normal saline for one day), and the remaining 24 rabbits were divided into three parallel groups and treated with 2% pilocarpine (3 times per day), 0.004%travoprost (per night), and their combination. On the 7th, 14th, and 24th day of the treatment, 2 rabbits in each drug-treated group were executed. Two rabbits in the control group were executed after treated with normal saline for one day. Eyeballs taken from these rabbits were fixed, and then the pathological specimens were prepared with hematoxylin-eosin (HE) staining and smooth muscle antibody (SMA) immunohistochemical staining. The morphological changes of ciliary smooth muscle and intracellular space were observed with optical microscope. Two normal rabbits from the control group were executed after normal saline treated for 1 day and 2 normal rabbits in each drug-treated group were executed after 24 days of treatment. All eyes of these rabbits were taken and emission electronic microscope specimens were made to observe the microstructure of ciliary muscle and extracellular matrix (ECM). Results Specimens of pilocarpine group showed the contraction of ciliary muscle. Specimens of travoprost group showed the relaxation of ciliary muscle, enlargement of the extracellular space, and decompose of ECM. Specimens of the combination group showed the contraction of anterior 1/3 part of ciliary muscle but the relaxation of posterior 2/3 part of ciliary muscle. Decomposition of ECM was more distinct in combination group than those of individual groups. Conclusions Compared with pilocarpine alone or travoprost alone, the combination of these two drugs does not increase the resistance of uveoscleral outflow pathway and probably can promote the aqueous fluid outflow by increasing the decomposition of ECM.

prostaglandin F2αanalogus；pilocarpine；combination；uveoscleral outflow pathway

趙家良 電話：010-69156358，E-mail：13501132676@163.com

R453.9

A

1674-9081(2014)01-0095-05

10.3969/j.issn.1674-9081.2014.01.020

2013- 01- 31)