河南省信陽市鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定和血清型分析

焦鳳超　李迎曉　陳宏智　肖世文

摘要：對(duì)河南省信陽市送檢的疑似鴨疫里默氏桿菌感染病鴨進(jìn)行病原菌的分離鑒定。根據(jù)培養(yǎng)特性和生化鑒定結(jié)果分離出6株鴨疫里默氏桿菌；經(jīng)平板凝集試驗(yàn)確定出血清1型1株，血清2型2株，另外3株未定型；人工感染試驗(yàn)表明，分離菌株對(duì)櫻桃谷肉雛鴨有很強(qiáng)的致病性。

關(guān)鍵詞：鴨疫里默氏桿菌；血清型；致病性

中圖分類號(hào)： S858.322.61文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0166-02

收稿日期：2013-05-17

基金項(xiàng)目：河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：122102110022）。

作者簡介：焦鳳超（1979—），男，河南西平人，碩士，講師，從事病原微生物與免疫學(xué)研究。E-mail：fengchaojiao@163.com。鴨疫里默氏桿菌病是由鴨疫里默氏桿菌（Riemerella anatipestifer）引起鴨、鵝、火雞以及其他鳥類的一種接觸傳染病[1]，別稱鴨傳染性漿膜炎，主要侵害2～8周齡的雛鴨，呈急性或慢性敗血癥，其特征是纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎，也可能發(fā)生無任何臨床癥狀的呼吸道感染，發(fā)病率5%～90%，死亡率高達(dá)90%[2]。由于該菌血清型眾多，各血清型間無交叉保護(hù)作用且存在地域差異，所以導(dǎo)致目前疫苗的免疫預(yù)防效果不是十分理想。本研究通過對(duì)河南省信陽市部分地區(qū)疑似鴨疫里默氏桿菌的分離鑒定和血清型分析，以期為該地區(qū)鴨疫里默氏桿菌病的免疫預(yù)防提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1病料病料取自河南省信陽市送檢的10份鴨疫里默氏桿菌病疑似病例的腦、心血、肝、脾等組織。

1.1.2菌株及陽性血清鴨疫里默氏桿菌1、2型菌株和標(biāo)準(zhǔn)血清由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)贈(zèng)送。

1.1.3主要培養(yǎng)基麥康凱瓊脂、TSA、TSB等培養(yǎng)基購自浙江杭州天和微生物試劑有限公司；小牛血清購自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.4細(xì)菌微量生化管細(xì)菌微量生化管購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.1.5試驗(yàn)動(dòng)物試驗(yàn)用健康櫻桃谷肉雛鴨購自河南華英集團(tuán)公司。

1.2方法

1.2.1病原菌分離無菌采集病死鴨的腦、心血、肝臟等病料，劃線接種到TSA（含5%小牛血清）培養(yǎng)基和麥康凱培養(yǎng)基上，置于燭缸內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察細(xì)菌的生長情況。在TSA培養(yǎng)基上生長而不能在麥康凱培養(yǎng)基上生長的菌落為可疑鴨疫里默氏桿菌，挑取單菌落在TSA（含5%小牛血清）培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，待進(jìn)一步鑒定[3]。

1.2.2病原菌染色鏡檢挑取TSA平板上單個(gè)可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏和瑞氏染色，鏡檢觀察形態(tài)。

1.2.3生化試驗(yàn)按程安春等的方法[4]采用微量發(fā)酵管（添加10%小牛血清）進(jìn)行常規(guī)生化試驗(yàn)。

1.2.4病原菌血清學(xué)鑒定參照程安春等的方法[5]，將分離的病原菌株純培養(yǎng)物進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)：在干凈載玻片中央滴加純化水1滴，用接種環(huán)蘸取經(jīng)過離心洗滌的分離菌少許，與純化水混勻，滴加未稀釋的陽性血清1滴。將載玻片反復(fù)振蕩或用接種環(huán)涂開，注意觀察結(jié)果。幾秒鐘后出現(xiàn)清晰的乳白色絮狀凝集塊者即判定為陽性反應(yīng)。陽性反應(yīng)者須重復(fù)3次上述操作以減少假陽性。

1.2.5人工感染試驗(yàn)將確定血清型的分離菌純化后，分別接種于加有5%小牛血清的TSB液體培養(yǎng)基上，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h后進(jìn)行純粹性檢驗(yàn)、細(xì)菌比濁計(jì)數(shù)，活菌含量約為 10億CFU/mL。取未免疫過鴨疫里默氏桿菌滅活疫苗的14日齡健康櫻桃谷鴨作為試驗(yàn)對(duì)象（每組10羽）。試驗(yàn)組以分離菌純培養(yǎng)物0.1 mL/羽接種，含菌數(shù)為1億CFU，第7組為對(duì)照組，接種等量的生理鹽水。接種后觀察10 d，記錄發(fā)病和死亡情況[6]。

2結(jié)果與分析

2.1細(xì)菌分離結(jié)果

試驗(yàn)表明，從10例鴨疫里默氏桿菌病疑似病例的腦、心血、肝、脾等組織中分離出6株疑似菌株，依次命名為XY1、XY2、XY3、XY4、XY5、XY6。6株鴨疫里默氏桿菌分離株均呈革蘭陰性、不運(yùn)動(dòng)、無芽孢、單個(gè)或成雙存在、偶見長絲狀的短小桿菌，瑞氏染色呈兩極濃染，符合鴨疫里默氏桿菌的形態(tài)特征。

2.2生化試驗(yàn)結(jié)果

分離菌均不發(fā)酵葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、果糖、乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、山梨醇等碳水化合物，靛基質(zhì)試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、尿素酶試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)均為陰性，不產(chǎn)生硫化氫、液化明膠、過氧化氫酶陽性?；痉哮喴呃锬蠗U菌的生化特性。

2.3血清型鑒定結(jié)果

將分離到的6株細(xì)菌分別與標(biāo)準(zhǔn)陽性血清進(jìn)行平板凝集試驗(yàn)，結(jié)果表明XY1、XY3均與抗鴨疫里默氏桿菌2型陽性血清發(fā)生凝集反應(yīng)；XY2與抗鴨疫里默氏桿菌1型陽性血清發(fā)生凝集反應(yīng)；XY4、XY5、XY6未定型。

2.4人工感染試驗(yàn)結(jié)果

試驗(yàn)組櫻桃谷雛鴨接菌24 h后開始出現(xiàn)精神沉郁、行動(dòng)遲緩、 排綠色稀糞、共濟(jì)失調(diào)等癥狀，3～5 d全部發(fā)病死亡。剖檢死鴨發(fā)現(xiàn)，其患有或輕或重的纖維素性心包炎、氣囊炎、肝周炎；并對(duì)死鴨進(jìn)行細(xì)菌分離，結(jié)果重新分離到接種菌，并能凝集相應(yīng)血清型的鴨疫里默氏桿菌。對(duì)照雛鴨均健存。

3結(jié)論與討論

目前鴨疫里默氏桿菌已呈全球性分布[7]。2002年前，學(xué)者普遍認(rèn)為鴨疫里默氏桿菌有21個(gè)血清型。2003年程安春等提出4個(gè)新的血清型存在，命名為22～25型[4]。2006年張大丙等提出血清10型還存在4個(gè)亞型，并鑒定出1個(gè)變異株以及2個(gè)可能的新型菌株[8]。因此鴨疫里默氏桿菌實(shí)際存在的血清型可能更復(fù)雜，且各血清型間的交叉保護(hù)性不強(qiáng)[9-12]。本研究參照程安春等介紹的平板凝集方法[5]共分離鑒定出6株鴨疫里默氏桿菌，其中3株為血清1型或血清2型，另外3株未定型，說明信陽市鴨群存在包括血清1型和血清2型在內(nèi)的多種血清型感染。由于采集病料和標(biāo)準(zhǔn)菌株、標(biāo)準(zhǔn)血清的局限，其他流行的血清型有待進(jìn)一步分離和鑒定。

由于該菌血清型眾多，且各地區(qū)流行的鴨疫里默氏桿菌優(yōu)勢血清型存在差異，使疫苗免疫預(yù)防效果不盡如人意，因此許多養(yǎng)殖戶紛紛放棄了疫苗轉(zhuǎn)而依靠使用藥物防治該病發(fā)生，從而導(dǎo)致了獸藥濫用、養(yǎng)殖成本增加以及耐藥菌株不斷增多，給食品安全帶來了很大的隱患。因此，選擇適合當(dāng)?shù)匮逍偷镍喴呃锬蠗U菌菌苗或進(jìn)行自家疫苗的研制是防治該病的關(guān)鍵。發(fā)病鴨群采用藥物治療時(shí)也應(yīng)根據(jù)本場分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，選擇高敏藥物，避免超量或?yàn)E用抗生素，以減少耐藥菌株的產(chǎn)生，降低食品藥物殘留的風(fēng)險(xiǎn)。

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