紅掌FLOWERING LOCUS T同源基因的克隆及生物信息學(xué)分析

馬廣瑩+鄒清成+劉慧春+周江華+朱開元

摘要：通過高通量測序技術(shù)獲得紅掌成花素基因FT，對其進(jìn)行序列分析，通過與已報(bào)道同源基因的比較，預(yù)測基因FT能夠顯著促進(jìn)轉(zhuǎn)基因植物開花，為開展紅掌分子育種提供了有益基因資源。

關(guān)鍵詞：紅掌；克??；基因FT；信息學(xué)；序列分析

中圖分類號： S682.03文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號：1002-1302（2014）02-0031-02

收稿日期：2013-06-18

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（編號：31200527）；浙江省自然科學(xué)基金（編號：Q13C150011）。

作者簡介：馬廣瑩（1982—），男，山東梁山人，博士，助理研究員，從事園林植物引種栽培及遺傳育種工作。E-mail：magypetunia@aliyun.com。為實(shí)現(xiàn)種群繁衍，植物必須在合適的時(shí)間進(jìn)行生殖生長、開花結(jié)果。許多植物調(diào)整開花時(shí)間的方式是根據(jù)環(huán)境信號（如日照長短、溫度等）來產(chǎn)生應(yīng)答反應(yīng)，植物內(nèi)源激素和年齡這2個(gè)內(nèi)部信號也可以誘導(dǎo)植物開花。近年來，通過對模式植物擬南芥的分子水平研究，人們總結(jié)出“光周期、春化、自主調(diào)控以及赤霉素”4條控制植物開花的途徑[1-3]。FLOWERING LOCUS T基因（FT基因）是學(xué)術(shù)界普遍認(rèn)可的成花素，于葉片中合成，然后通過韌皮部運(yùn)輸?shù)巾敹朔稚M織，F(xiàn)T與FD基因互作，誘導(dǎo)下游成花基因的表達(dá)，促進(jìn)開花[4-5]。

擬南芥（Arabidopsis thaliana）中存在6類FT-like基因，都可能參與了成花誘導(dǎo)，這些基因有著共同的PEPB結(jié)構(gòu)域[6]。本研究經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序，克隆到了1個(gè)紅掌（Anthurium andraeanum）PEPB基因，通過序列對比等生物信息學(xué)分析，確定該基因是1種促進(jìn)開花的功能基因，這為今后通過轉(zhuǎn)基因手段培育矮化的早花紅掌品種、縮短紅掌育種年限提供了重要的資源。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

紅掌品種為“阿拉巴馬”，取盛花期植株幼嫩葉片、苞片、花序3個(gè)組織進(jìn)行混合，按照美國Invitrogen公司生產(chǎn)的植物RNA提取試劑盒（貨號：12322-012）提取總RNA，構(gòu)建Illumina文庫，并委托上海美吉生物公司采用Illumina Hiseq 2000對文庫進(jìn)行測序。

1.2序列分析軟件及分析方法

通過測序獲得的基因序列，經(jīng)過NCBI 網(wǎng)站ORFFinder軟件進(jìn)行編碼區(qū)預(yù)測，然后用http：//prosite.expasy.org/網(wǎng)站進(jìn)行編碼區(qū)氨基酸序列預(yù)測，并進(jìn)行序列保守結(jié)構(gòu)域的檢索[7]，采用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列氨基酸比對，采用MEGA5進(jìn)行多物種FT基因進(jìn)化關(guān)系分析[8]，建樹方法為Neighbor-joining，bootstrap 1 000次。

2結(jié)果與分析

2.1紅掌FT基因獲得

通過測序，獲得了與水稻FT基因相似度較高的1條EST序列，通過比對分析，初步確定其為紅掌FLOWERING LOCUS T基因的同源物，命名為AaFT。如圖1所示，該基因編碼區(qū)核苷酸序列有525 bp，其余部分為UTR區(qū)域。用該區(qū)域序列進(jìn)行氨基酸推測，得到了174個(gè)氨基酸殘基。

2.2AaFT基因生物信息學(xué)分析

通過在線軟件分析，不僅推測出該基因的氨基酸序列，還找到了該序列中存在PBP結(jié)構(gòu)域所在的位置，該結(jié)構(gòu)域共計(jì)23個(gè)氨基酸殘基，序列為YTLVMVDPDAPSPSDPNLREYLH，起始位置為64～86號氨基酸。

為了更好地分析該基因的保守性及與同類基因的相似度，將其與擬南芥FT基因（AtFT）進(jìn)行序列比較。由圖2可見，擬南芥與紅掌FT基因的序列相似度比較高，二者在FT基因關(guān)鍵氨基酸殘基上有著相同的組成，即第85、140號氨基酸殘基分別為酪氨酸、谷酰胺。

用MEGA軟件構(gòu)建了6種不同物種FT基因的進(jìn)化樹。從圖3可見，單、雙子葉植物FT基因同源性差異明顯，屬于單子葉植物的紅掌與水稻（Oryza sativa，登錄號：AB052943.1）、蕙蘭（Cymbidium faberi，登錄號：KC138734.1）、蝴蝶蘭（Phalaenopsis hybrid，登錄號：KC138805.1）、小麥（Triticum aestivum，登錄號：AY705794.1）親緣關(guān)系較近，聚類時(shí)容易聚在一起，而紅掌FT基因與擬南芥相比，親緣關(guān)系則明顯較遠(yuǎn)，這也與二者分屬單、雙子葉植物類別相對應(yīng)。

3小結(jié)與討論

FT基因作為成花素，受到廣泛關(guān)注，目前，已經(jīng)有非常多植物的FT基因被成功克隆出來，在促進(jìn)植物開花方面表現(xiàn)十分優(yōu)異[9]。紅掌作為國內(nèi)外重要的高檔盆栽花卉，目前育種工作主要集中在常規(guī)雜交育種方面，分子育種剛剛起步，紅掌FT基因的克隆為通過轉(zhuǎn)基因手段快速培育紅掌新品系、縮短雜交育種年限提供了有利條件，也為微型紅掌品種的開發(fā)提供了可能。

本試驗(yàn)通過高通量測序技術(shù)獲得了1條包含完整編碼框的FT基因序列，通過比對及生物信息學(xué)分析，確定該基因?yàn)榧t掌FT同源基因。前人研究證明，F(xiàn)T基因家族存在著序列高度相似、功能完全相反的成員——TFL[10-11]，但是二者在關(guān)鍵氨基酸組成上存在著明顯區(qū)別，通過比較分析，本研究所克隆的基因序列在85號及140號氨基酸組成上與擬南芥促進(jìn)早花的FT基因完全一致，結(jié)合相似序列，確定該基因是FT基因，其功能應(yīng)該是促進(jìn)植物開花，而非抑制植物開花。

用紅掌FT基因與擬南芥比較，雖然二者分屬于單、雙子葉植物類別，但是兩基因在氨基酸組成的高度相似說明了FT基因在進(jìn)化過程中保持著穩(wěn)定性，這可能是其發(fā)揮早花功能的必備條件。與多物種FT基因進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)紅掌FT基因與其他單子葉植物之間存在著較大遺傳距離，說明FT基因雖然功能上保持著穩(wěn)定性，但隨著物種的進(jìn)化而不斷發(fā)生變異，深入研究該基因及其家族成員，有利于解析不同物種的進(jìn)化模式。

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