建立科研型肝癌肝移植標(biāo)本庫質(zhì)量控制體系的初步探討

王樂天，張 慶，郝昱文，陳 虹，陳新國，沈中陽

建立科研型肝癌肝移植標(biāo)本庫質(zhì)量控制體系的初步探討

王樂天1，張 慶1，郝昱文2，陳 虹1，陳新國1，沈中陽1

目的 探討建立科研型肝癌肝移植臨床標(biāo)本庫質(zhì)量控制體系，制定規(guī)范化的肝癌肝移植標(biāo)本采集、處理、保存操作流程及標(biāo)本信息化管理系統(tǒng)。方法 借鑒國內(nèi)外建立標(biāo)本庫的標(biāo)準(zhǔn)化程序，制定肝癌肝移植標(biāo)本庫操作流程及質(zhì)量控制體系，規(guī)范化收集、處理及保存肝癌肝移植受者的腫瘤組織及血液標(biāo)本，同時收集良性肝病肝移植受者以及健康供者的肝組織及血液標(biāo)本作為研究對照。對所收集的標(biāo)本及相關(guān)的臨床資料信息進(jìn)行系統(tǒng)化管理。結(jié)果 自2009-08肝癌肝移植標(biāo)本庫現(xiàn)收集有完整臨床資料的501例肝移植供、受者的組織及術(shù)前/術(shù)后血液標(biāo)本。其中，肝癌標(biāo)本包括腫瘤組織、癌旁組織及遠(yuǎn)端非癌組織標(biāo)本共計1773份。隨機抽取45例標(biāo)本進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)測，顯示標(biāo)本取材的準(zhǔn)確率達(dá)90%以上，標(biāo)本質(zhì)量較好。開發(fā)了規(guī)范化的標(biāo)本信息資料計算機管理系統(tǒng)。結(jié)論 初步建立了具有一定規(guī)模的科研型肝癌肝移植標(biāo)本庫質(zhì)量控制體系，有利于提高標(biāo)本的質(zhì)量，為肝移植研究提供了規(guī)范化的臨床樣本資源平臺。

肝細(xì)胞肝癌；肝移植；生物樣本庫；規(guī)范化收集；信息化管理

我國是肝癌高發(fā)區(qū)，患者就診時多伴有肝炎相關(guān)肝硬化。肝移植是目前唯一同時治療肝癌和肝硬化的有效手段[1,2]。但移植術(shù)后肝癌的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移制約了肝移植的發(fā)展，深入研究攻克肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移難題勢在必行。建立規(guī)范化的肝癌肝移植標(biāo)本庫可以最大限度地保護并合理利用肝癌組織標(biāo)本資源，提供臨床標(biāo)本資源平臺，促進(jìn)肝癌肝移植的研究。鑒于國內(nèi)尚未建立規(guī)范的科研型肝癌肝移植標(biāo)本庫，我們自2009年利用我院肝移植規(guī)模處于國內(nèi)前列的優(yōu)勢，標(biāo)準(zhǔn)化地收集和保存了肝癌肝移植供者和受者的標(biāo)本。受者的病肝標(biāo)本包括肝癌組織、癌旁組織、遠(yuǎn)端非腫瘤組織，并建立了與肝癌標(biāo)本相關(guān)的臨床診治、術(shù)后隨訪等資料及知情同意等倫理資料的信息管理系統(tǒng)，從而初步建立了符合國際規(guī)范的肝癌肝移植臨床樣本庫，為肝癌肝移植研究提供了寶貴的臨床樣本資源。

1 對象與方法

1.1 對象 均為自2009-08在我院住院等待實施肝移植的肝癌患者及終末期良性肝病患者(包括乙肝或丙肝合并肝硬化、自身免疫性肝病、酒精性肝硬化、急性肝衰竭、肝豆?fàn)詈俗冃浴⒉技泳C合征等)。全部病例均經(jīng)臨床化驗檢查及病理學(xué)檢查明確診斷。標(biāo)本庫由病理技術(shù)員專人負(fù)責(zé)，熟悉收集流程、熟練掌握標(biāo)本處理操作規(guī)范及質(zhì)量控制方法。

1.2 主要設(shè)備 -86 ℃超低溫冰箱 (海爾 DW-86L626 型，規(guī)格箱內(nèi)溫度范圍-40～-86 ℃，溫度波動值≤6 ℃),-40 ℃冰箱(海爾DW-40L262型，規(guī)格：箱內(nèi)溫度范圍-20～-40 ℃)，6升的液氮罐(YDS-6，靜態(tài)液氮保存天數(shù)≥53 d，四川東亞液氮罐廠),全自動脫水機(規(guī)格型號：VIP-6 ，日本櫻花SAKURA公司)、石蠟包埋機(規(guī)格型號：5232 TEC 5 EM J-2，日本櫻花SAKURA公司)、凈化工作臺(規(guī)格型號：SW-CJ-2FD、潔凈等級：100級@≥0.5 μm， 蘇州凈化設(shè)備有限公司)、L500低速自動平衡離心機(L500型，規(guī)格：最高轉(zhuǎn)速 5000 r/min，總功率 200 W，最短加/減速時間 30 s/25 s，最大相對離心力 4030 g，長沙湘儀離心機儀器有限公司)。

1.3 主要試劑 血液、組織DNA提取試劑盒(德國QIAgen試劑盒)、淋巴細(xì)胞分離液(上海恒信化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品)、無水乙醇(北京化工廠)、RNAase (美國Omega公司)等。

1.4 標(biāo)本收集前的準(zhǔn)備 肝移植術(shù)前征得患者及其家屬知情同意,簽署知情同意書。由科室住院總醫(yī)師負(fù)責(zé)確定標(biāo)本收集的研究對象及通知采集時間。組織標(biāo)本由專門負(fù)責(zé)標(biāo)本庫的病理技術(shù)員進(jìn)行采集，并負(fù)責(zé)提前準(zhǔn)備標(biāo)記好的凍存管、留取血清和血漿的醫(yī)用采血管、轉(zhuǎn)移式液氮罐、不銹鋼標(biāo)尺、10%甲醛溶液、照相機、標(biāo)本資料表等工作。組織標(biāo)本采集工作在手術(shù)室進(jìn)行，采集器械由手術(shù)室提供。

1.5 標(biāo)本的規(guī)范化收集與貯存

1.5.1 新鮮凍存標(biāo)本收集、處理及保存 當(dāng)肝癌肝移植受者的完整病肝組織切除離體后，立即用數(shù)碼相機拍攝大體標(biāo)本外觀(包括標(biāo)尺，顯示肝癌的大小等)，在病肝組織離體后30 min內(nèi)，除首先留取保證用于病理科進(jìn)行診斷的足夠量腫瘤及癌旁組織標(biāo)本，將剩余病肝組織按癌組織、癌旁組織(距離腫瘤組織2 cm)和切緣遠(yuǎn)端非癌組織(距離腫瘤組織>5 cm左右)進(jìn)行多位點采集。健康供肝組織的標(biāo)本采集需保證供肝質(zhì)量及完整性的前提下進(jìn)行獲取，原則上按肝穿活檢的組織大小(直徑約0.2 cm)在肝邊緣處(血管分布較少區(qū)域)切取。

1.5.1.1 凍存標(biāo)本HE染色 HE染色主要用于診斷和檢驗切取的標(biāo)本質(zhì)量是否合格。冷凍樣本室溫下解凍后脫水、石蠟包埋，制成切片進(jìn)行HE染色，顯示腫瘤組織面積大于70%以上者為合格標(biāo)本。

1.5.1.2 提取DNA的凍存標(biāo)本 每例患者的每種組織(癌、癌旁及遠(yuǎn)端非癌組織)平均切成3～6份標(biāo)本(根據(jù)腫瘤大小)，每份標(biāo)本的重量原則上在2.5 g左右(直徑約0.5 cm，厚度約0.5 cm)， 分別裝入2 ml已滅菌標(biāo)記的凍存管中，并迅速置于轉(zhuǎn)移式液氮罐中，于30 min內(nèi)再轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱中長期保存。

1.5.1.3 提取RNA的凍存標(biāo)本 在切取組織(切取組織大小依據(jù)病肝腫瘤體積)的時候，為防止 RNA 降解，需快速取下組織，將每塊組織用滅過菌的 DEPC水溶液快速沖洗后，迅速裝于用0.1%的DEPC水處理過高溫滅菌的2 ml凍存管中，快速置于轉(zhuǎn)移式液氮中。于30 min內(nèi)再轉(zhuǎn)入-80 ℃超低溫冰箱中長期保存。切取過程按無菌操作進(jìn)行，取不同患者標(biāo)本時應(yīng)更換刀片及器械。此外，分別取一小塊新鮮肝癌組織和癌旁組織(約黃豆大小 )，放入滅菌滅酶的EP管中用于標(biāo)本入庫前的質(zhì)量檢測。

1.5.2 石蠟組織標(biāo)本收集、處理及保存 選擇離體后病肝組織中包含腫瘤及癌旁組織的標(biāo)本進(jìn)行切取，或者非腫瘤的病肝(良性肝病合并肝硬化)組織進(jìn)行切取和固定，24 h后制備成石蠟標(biāo)本塊。石蠟塊存放于病理標(biāo)本柜中常溫保存。

1.5.3 血液標(biāo)本的收集、處理及保存

1.5.3.1 血液標(biāo)本的收集 血液標(biāo)本的收集在病房進(jìn)行，嚴(yán)防標(biāo)本被異物污染。由責(zé)任醫(yī)師負(fù)責(zé)準(zhǔn)備貼有醫(yī)院標(biāo)簽及信息的血液采集管，并安排護士采集血液標(biāo)本。采血在早晨患者進(jìn)食前進(jìn)行。采集方式為外周靜脈穿刺取血。采集每名患者及健康供肝者術(shù)前和術(shù)后1 周的血液標(biāo)本15 ml，其中非抗凝血5 ml、抗凝血10 ml。責(zé)任醫(yī)師負(fù)責(zé)將采集的血液標(biāo)本交至標(biāo)本庫技術(shù)員，技術(shù)員于采血后3 h內(nèi)完成血液標(biāo)本的分離和保存。標(biāo)本處理結(jié)束后，由技術(shù)員填寫血液標(biāo)本登記表，并注明分離日期、時間、患者信息、標(biāo)本信息，以及存放方式和具體位置。

1.5.3.2 血液標(biāo)本的分離及保存 提取血漿及血清方法參照文獻(xiàn)[3]。將提取的血清和血漿分裝到0.5 ml離心管內(nèi)，每管約200 μl。低溫冷凍保存(-80 ℃冰箱)，登記存檔。

提取血液DNA按照試劑盒說明書步驟操作，采用紫外分光光度儀(UVmini-1240)定量。將所有DNA分裝及標(biāo)記編號后，置于-80 ℃保存。

1.6 標(biāo)本信息化管理 管理人員嚴(yán)格按照標(biāo)本入庫、出庫及保存規(guī)定進(jìn)行規(guī)范化管理。自行設(shè)計并開發(fā)信息管理系統(tǒng)應(yīng)用于肝癌肝移植標(biāo)本庫的管理，系統(tǒng)軟件為Windows XP + Microsoft sqlserver2000 +IIS。系統(tǒng)功能錄入內(nèi)容主要有患者信息、供體信息、標(biāo)本信息、標(biāo)本使用管理與使用置記、標(biāo)本質(zhì)量控制等。

2 結(jié) 果

2.1 標(biāo)本收集 肝癌肝移植標(biāo)本庫現(xiàn)保存有完整臨床資料的肝移植供、受者501例肝癌及良性肝病(研究對照)組織及血液標(biāo)本。其中肝癌標(biāo)本203例，良性肝病標(biāo)本214例，健康供肝者84例。肝癌組織標(biāo)本包括腫瘤組織、癌旁組織、遠(yuǎn)端正常組織。目前保存了包括肝癌組織、癌旁組織及遠(yuǎn)端非癌組織標(biāo)本共計1773份，良性肝病肝硬化組織1320份，正常供肝組織84份。術(shù)前共收集肝移植受者血清和血漿均為398份，術(shù)后共收集受者血清和血漿分別為181份和179份；術(shù)前/術(shù)后血液DNA收集分別為356份和162份；術(shù)前/術(shù)后血液淋巴細(xì)胞收集分別為239份和113份。術(shù)前收集健康供者血清和血漿均為71份，術(shù)前/術(shù)后血液DNA收集分別為69份和52份。所收集對象的年齡為2～75歲，平均(47.2±12.1)歲；男437例(占87.2%)，女64例(占12.8%)。

2.2 標(biāo)本質(zhì)量監(jiān)測

2.2.1 取材部位的準(zhǔn)確性 筆者抽取45例已收集的新鮮凍存肝癌標(biāo)本進(jìn)行HE染色，其中42例包含的腫瘤組織面積≥80%,標(biāo)本取材的準(zhǔn)確率達(dá)90%以上；包含的腫瘤組織面積<80%的3例中有2例見腫瘤壞死組織(胞核消失)，考慮可能為術(shù)前抗腫瘤局部治療(肝動脈化療栓塞及射頻消融術(shù))導(dǎo)致部分腫瘤組織壞死，1例為小肝癌，考慮為標(biāo)本剩余量不足所致。

2.2.2 標(biāo)本DNA、RNA的提取和鑒定 筆者對收集的凍存組織提取RNA，經(jīng)紫外分光光度計分析A260/A280 均在1.6～1.8，對總RNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)標(biāo)本的完整性較好，受檢45例凍存組織樣本的RNA均可見清晰的28S 及18S 條帶，表明有較好的RNA完整性(圖1)。此外，利用凝膠電泳實驗檢測樣本DNA的質(zhì)量，結(jié)果顯示所有檢測的DNA完整性良好，無降解，電泳條帶清晰(圖2)，能夠滿足科研實驗的要求。以上結(jié)果表明本試驗中凍存組織標(biāo)本的取材、處理及保存操作方法及程序可確保標(biāo)本質(zhì)量合格。

筆者對采集的外周血液提取DNA和RNA的監(jiān)測結(jié)果顯示標(biāo)本的合格率分別為94%和91%，達(dá)到科研實驗的要求。少數(shù)標(biāo)本DNA和RNA含量較少考慮可能與肝癌患者外周血中白細(xì)胞較低有關(guān)。

2.3 肝癌肝移植標(biāo)本信息化管理系統(tǒng)的建立 制作了適合標(biāo)準(zhǔn)化生物標(biāo)本庫要求且規(guī)范化的醫(yī)用資料計算機管理系統(tǒng), 建立起包括腫瘤組織標(biāo)本數(shù)據(jù)庫、血液標(biāo)本數(shù)據(jù)庫、臨床信息數(shù)據(jù)庫、隨訪資料數(shù)據(jù)庫在內(nèi)的肝癌肝移植臨床標(biāo)本數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)，完成了標(biāo)本庫信息數(shù)據(jù)管理軟件的開發(fā)工作。

圖1 所收集肝癌凍存組織提取的RNA電泳圖

圖2 所收集肝癌凍存組織提取的DNA電泳圖

3 討 論

筆者自2009年8月起收集了501例肝癌及良性肝病(作為研究對照)肝移植供、受者的組織標(biāo)本和血液標(biāo)本，建立了科研型肝癌肝移植臨床標(biāo)本庫。患者在簽署知情同意書后,經(jīng)過專職人員收集移植患者的血液標(biāo)本和手術(shù)摘除病肝組織標(biāo)本，納入標(biāo)本收集數(shù)據(jù)庫系統(tǒng)。血液標(biāo)本的采集與保存由專職技術(shù)人員在相同條件下采集、保存，以避免人為偏差。此外，我所建立了肝移植患者術(shù)后隨訪門診及隨訪信息網(wǎng)站，因此具備較完整的患者術(shù)后長期隨訪信息數(shù)據(jù)，為肝癌肝移植術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的診斷及防治領(lǐng)域研究提供了可靠、準(zhǔn)確的資源平臺。

標(biāo)本質(zhì)量控制是建立規(guī)范化標(biāo)本庫的關(guān)鍵[3-5]。筆者建立的科研型肝癌肝移植標(biāo)本庫質(zhì)量控制體系包括完整的硬件設(shè)施、規(guī)范的操作流程、科學(xué)的信息管理系統(tǒng)、準(zhǔn)確的臨床病理資料、隨訪系統(tǒng)及專業(yè)的技術(shù)人員。完整的硬件設(shè)施要求具備-80 ℃以下的低溫冰箱或液氮保存裝置、嚴(yán)格的溫控設(shè)備和監(jiān)控設(shè)備，防止斷電及其他電力故障，避免標(biāo)本反復(fù)凍融。標(biāo)本的收集嚴(yán)格按照腫瘤組織標(biāo)本的相關(guān)要求和流程進(jìn)行規(guī)范操作，包括取材部位的準(zhǔn)確性，組織離體后30 min內(nèi)將組織置入液氮速凍或-80 ℃深低溫冷凍保存等。組織標(biāo)本的離體時間對于標(biāo)本的保存質(zhì)量至關(guān)重要。多數(shù)學(xué)者推薦標(biāo)本應(yīng)在切除后30 min內(nèi)取材并保存[6,7]，以避免基因組DNA～RNA和蛋白的降解。筆者對庫存標(biāo)本進(jìn)行隨機抽樣，進(jìn)行DNA～RNA提取鑒定，證實利用本實驗中制定的規(guī)范化標(biāo)準(zhǔn)化程序，有利于建立高質(zhì)量的的肝癌肝移植標(biāo)本庫。標(biāo)本規(guī)范的采集和保存是樣本質(zhì)量符合科學(xué)研究的重要條件。為了保證標(biāo)本庫中存放的標(biāo)本的質(zhì)量，需要定期抽查組織進(jìn)行實驗，檢測標(biāo)本是否發(fā)生降解等質(zhì)量問題，這是保障標(biāo)本庫質(zhì)量的重要手段。

本標(biāo)本庫均由指定的病理技術(shù)員專人進(jìn)行標(biāo)本采集、管理與錄入，以保證標(biāo)本取材的準(zhǔn)確性。筆者對收集的組織標(biāo)本進(jìn)行抽樣檢測，標(biāo)本取材的準(zhǔn)確率達(dá)90%以上。對于大肝癌或巨大肝癌組織，由于可能存在腫瘤中央組織缺血壞死，故選擇腫瘤邊緣取材；對于小肝癌及微小肝癌，存在留取病理科送檢標(biāo)本后腫瘤剩余量較少，不夠取材新鮮標(biāo)本和石蠟標(biāo)本。這種情況下，筆者首先確保石蠟標(biāo)本的收集。因為石蠟標(biāo)本保存時間長，操作簡便、利用率高。專業(yè)的技術(shù)和管理人員是標(biāo)本庫質(zhì)量控制體系關(guān)鍵所在[8]。

筆者制作了規(guī)范化的標(biāo)本信息資料計算機管理系統(tǒng),通過對501例肝癌及良性肝病肝移植供、受者標(biāo)本信息的錄入和初步分析，檢驗了該系統(tǒng)擁有完善的數(shù)據(jù)錄入、查詢、分析界面，可以提供簡單便捷的管理系統(tǒng)，有效提高標(biāo)本信息管理的準(zhǔn)確性和可操作性。此外，由于患者肝移植術(shù)后需長期終生隨訪，本實驗中利用我院移植門診錄入的隨訪信息系統(tǒng)，收錄了患者肝移植術(shù)后的隨訪信息，建立了全面、完善的肝癌肝移植標(biāo)本信息化管理系統(tǒng)。

高質(zhì)量的臨床標(biāo)本是進(jìn)行科學(xué)研究的先決條件。建立規(guī)范化的肝癌肝移植標(biāo)本庫可為肝移植領(lǐng)域研究提供珍貴的臨床樣本資源，不僅可以充分保護、合理利用肝癌肝移植標(biāo)本資源，還可確?？蒲泄ぷ鞯恼_性和科學(xué)性，對促進(jìn)肝癌肝移植研究的發(fā)展具有十分重要的醫(yī)學(xué)意義。

[1] Vitale A，Volk M，Cillo U. Transplant benefit for patients with hepatocellular carcinoma[J]. World J Gastroenterol, 2013,19(48):9183-9188.

[2] Belghiti J，F(xiàn)uks D. Liver resection and transplantation in hepatocellular carcinoma[J]. Liver Cancer，2012,1(2): 71-82.

[3] Hughes S，Barnes R O，Watson P H.Biospecimen use in cancer research over two decades[J].Biopres Biobank，2010，8(2)：89-97.

[4] 高 丹，喻晶晶，梁慧芳，等.肝癌生物樣本庫的建立和質(zhì)量鑒定[J].實用醫(yī)學(xué)雜志，2013， 29(11)：1734-1735.

[5] Moore H M，Kelly A，Jewell S D，etal.Biospecimen Reporting for Improved Study Quality(BRISQ)[J].J Proteome Res，2011，10(8)：3429-3438.

[6] Mager S R, Oomen M H, Morente M M，etal.Standard operating procedure for the collection of fresh frozen tissue samples[J].Eur J Cancer,2007，43(5): 828-834.

[7] 和 鋼，孟慶勇，張 順，等.腫瘤組織庫存標(biāo)本的質(zhì)量控制[J].浙江中西醫(yī)結(jié)合雜志,2009，19(7):412-414.

[8] 孫榮國，賈曉蓉.對我國臨床標(biāo)本庫建設(shè)的建議[J].衛(wèi)生軟科學(xué)，2012，26(9)：772-773.

(2014-07-05收稿 2014-07-20修回)

(責(zé)任編輯 岳建華)

To establish quality control system of research-based clinical transplantation specimens bank for hepatocellular carcinoma

WANG Letian1, ZHANG Qing1, HAO Yuwen2, CHEN Hong1, CHEN Xinguo1, and SHEN Zhongyang1.

1.Institute of Organ Transplantation, 2.Computer Management Center， General Hospital of Chinese People’s Armed Police Forces, Beijing 100039, China

Objective To study the quality control system for establishment of liver transplantation(LT)biological specimen (bio-specimens) bank for hepatocellular carcinoma(HCC), development of a standardized HCC for LT bio-specimens collection, processing and preservation operation process. To establish at sound and comprehensive information management system to conduct a systematic management of clinical information of collected specimens. Methods Referring to standardized procedures to establish bio-specimens banks, the operational processes system in HCC for LT sample collection and quality control system were developed and standardized. Liver tissue and blood samples of HCC patients for LT were collected, While liver tissue and blood samples of benign liver disease in liver transplant recipients and of healthy donor were collected as a research control. A systematic management of clinical information of specimens collected was conducted. Results From the development of standardized sample collection procedures, in August 2009, and from 501 recipients and donors for LT, specimens of tissues and blood samples were collected. The total number of HCC specimens including tumor tissues, adjacent tissues and remote non-cancerous tissue specimens was 1773. And 45 were randomly selected for DNA and RNA testing; the results proved that the accuracy rate of pathological sampling was above than 90% and these collected specimens had a high quality. HCC specimen information data computer management was established and improved. Conclusions The initial establishment of standardized research-based clinical transplantation specimens bank for HCC is helpful to improving the efficiency of sample collection and quality. It provides a standardized samples resources platform for scientific research in the field.

hepatocellular carcinoma；liver transplantation；bio-specimens bank；standardized collection；information management

國家自然科學(xué)基金項目(81372595)；首都臨床特色應(yīng)用研究項目(Z121107001012168)；武警總醫(yī)院院內(nèi)資助項目二類(WZ2010027)

王樂天，碩士，主管技師，E-mail: wanglt527@126.com

100039北京，武警總醫(yī)院：1.肝移植研究所, 2計算機管理中心

張 慶,E-mail: zqy6920@sina.com

R735.3