不同取材時期和處理方法對瓦松無菌體系建立的影響

李慶偉　梁明勤　樊亞敏　劉榮寧　賀愛利

摘要：以瓦松植株為外植體進行組織培養(yǎng)，探索不同取材時期、處理方法、消毒時間、激素配比等對其無菌體系建立的影響，結果表明，無菌體系建立的材料以5月上旬取材、取材后對材料進行假植處理、剪去新萌生的莖段作為外植體為宜；材料用0.1%的HgCl2溶液消毒10 min后接種，污染率在5%以下，存活率在92%以上；在MS+NAA 0.1 mg/L+6-BA 0.5 mg/L的啟動培養(yǎng)基中，芽啟動率為99.78%，外植體并沒有出現(xiàn)愈傷組織、玻璃化等現(xiàn)象。

關鍵詞：瓦松；取材時期；處理方法；無菌體系

中圖分類號： Q945.52文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）01-0055-03

收稿日期：2013-05-09

基金項目：河南農業(yè)職業(yè)學院重點項目（編號：HNAC2011KY002）。

作者簡介：李慶偉（1979—），男，河南封丘人，碩士，講師，研究方向為種苗繁育與大蒜生產。E-mail：liqingwei2003@163.com。瓦松（Orostachys fimbriatus）別稱瓦花、瓦塔、瓦玉等，為景天科瓦松屬2年生草本肉質植物，在河南、江蘇等省及朝鮮、日本等國家和地區(qū)有分布[1]。瓦松植株中含有多種酸類、景天庚酮糖苷及異丙叉基景天庚酮糖苷等物質[2-5]，主要用于藥物合成，目前，利用瓦松參與合成的藥品不下27種。在臨床上，主要用于治療宮頸糜爛、腎性皮膚瘙癢、痔瘡、口腔潰瘍等癥狀[6-9]。隨著研究深入，以瓦松為原材料加工而成的藥品，將更多地應用在臨床上。自然條件下，瓦松生存完全依靠自生自滅。近年來，由于受氣候異常變化、花期采藥、生境發(fā)生變化等影響，瓦松資源受到嚴重破壞，保護瓦松資源刻不容緩。目前，國內外并沒有發(fā)現(xiàn)關于瓦松繁殖，尤其是快速繁殖的研究報道。探索并利用生物技術手段，對瓦松進行種苗繁育技術研究，對深度挖掘瓦松的潛在藥用價值，進一步加快瓦松的開發(fā)利用具有十分重要的意義。

1材料與方法

1.1試驗材料

供試材料采于當?shù)剞r村15年以上的瓦房上，分別在2月上旬、5月上旬、7月上旬、10月上旬拔取全株瓦松，用帶葉莖段作為接種材料。

1.2外植體消毒

采用2種外植體選擇方法進行消毒。方法1為直接消毒接種：在自來水下清洗表面泥土與灰塵，后剪成3～5 cm長莖段，用自來水沖洗30 min，對2月上旬采集的材料，去根、留蓮座狀葉和芽，直接用水沖洗；置于超凈工作臺上用0.1% HgCl2分別浸泡2、4、6、8、10、12、14 min，無菌水沖洗4次，瀝干水于無菌紙上。方法2為假植后消毒接種：材料假植于花盆中，套塑料袋，于室內25 ℃下培養(yǎng)5～7 d；剪新萌生嫩莖直接用0.1% HgCl2消毒，消毒時間同上。

消毒后莖段，剪成帶葉的莖段接種于初代培養(yǎng)基中，每瓶接種1個莖段，每個處理均接種15瓶。

1.3材料培養(yǎng)

初代培養(yǎng)基，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，采用2因素完全隨機設計（表1）。培養(yǎng)基采用高壓蒸汽滅菌，在121 ℃、1.1 kg/cm2 壓力下滅菌15 min。接種材料置于溫度24～26 ℃、光照時間14 h/d、光照強度 30 μmol/（m2·s） 的條件下進行培養(yǎng)。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

接種后2 d開始調查，后每隔3 d調查1次，記載污染發(fā)生的時間、類型、部位，外植體受傷害情況，腋芽初始萌動時間、腋芽萌動程度、材料的生理狀態(tài)等，接種后22 d統(tǒng)計污染情況，接種后30 d統(tǒng)計材料存活、傷害情況、腋芽萌動等。根據(jù)統(tǒng)計結果計算污染率、存活率、啟動率等，公式如下：污染率=污染外植體數(shù)/接種總數(shù)×100%；存活率=存活個體數(shù)/接種總數(shù)×100%；啟動率=萌芽個體數(shù)/接種總數(shù)×100%。

數(shù)據(jù)用SPSS 13.0軟件進行方差分析，采用鄧肯氏新復極差測驗進行多重比較。試驗中全部處理小于1的百分數(shù)，經(jīng)反正弦轉換后，進行分析和比較。

2結果與分析

2.1取材時期和方法對無菌體系建立的影響

由圖1可見，瓦松取材時期和方法不同，組培苗污染率存在很大差異；2月上旬取材后直接消毒接種（方法1）污染率最高，達100%，10月上旬、7月上旬取材次之；5月上旬取材污染率最低，2種方法平均污染率22.2%。這可能是由于5月瓦松種子萌動后剛開始大量生長，生命力較旺盛，且外植體在空氣中暴露時間較短，隨著在空氣中暴露時間的增加，外植體表面匯集大量微生物，組織培養(yǎng)時直接進行消毒，并不能將表面的微生物全部殺死；進入冬季，瓦松植株為適應環(huán)境條件變化，進入休眠，整個植株生長停止，葉片緊緊閉合，體內積累大量微生物，消毒時，消毒劑只能將裸露在表面的微生物殺死，并不能殺死植株內的微生物，從而造成2月份污染率居高不下。從選用不同的外植體進行消毒接種看，在同一時期，直接消毒接種的組培苗污染率均高于假植后消毒接種的（方法2）。5月份是瓦松最佳的取材時期，外植體假植后，選取植株上萌生的新莖段作為外植體，可使組培苗污染率最低。

2.2消毒時間對無菌體系建立的影響

由表1可見，隨著HgCl2消毒時間的增加，外植體的污染率明顯降低；對于選用不同外植體進行消毒接種，方法1組培苗的污染率和HgCl2消毒時間成負相關性，消毒時間越長，污染率越低，2、4 min處理的污染率最高（100%），12、14 min處理的污染率最低（0），且外植體的存活情況不受影響，這說明外植體表面存在大量保護組織，能避免受傷害，方法2組培苗的污染率和HgCl2消毒時間也表現(xiàn)為負相關性，其外植體的存活情況（存活率）和消毒時間也成負相關關系，消毒時間越長，受傷害的外植體材料越多，存活率越低，這說明假植處理后，新萌生的莖段表面缺乏保護性組織；對于在相同的消毒時間條件下，方法2組培苗的污染率要明顯低于方法1，這可能與二者的生長環(huán)境有關，方法1的植株長期暴露在自然環(huán)境下，其體表攜帶大量的微生物，而方法2新萌生的莖段，可能攜帶微生物含量少，但對于存活率，消毒時間較短時表現(xiàn)不明顯，隨著消毒時間的增長，方法2組培苗的存活率明顯低于方法1，這可能與二者的生理狀態(tài)有關，經(jīng)過假植的瓦松苗組織相對更幼嫩一些。

綜合瓦松外植體的污染率、存活率及其處理方法等指標，認為采用假植后剪取新生莖段，0.1% HgCl2浸泡10 min作為瓦松無菌體系建立外植體消毒的最佳時間。

為檢驗0.1 HgCl2消毒10 min對假植后新生莖段的效果，通過消毒較長莖段或消毒后每瓶接種多個材料進行驗證（圖2），發(fā)現(xiàn)材料的存活率在92%以上，污染率在5%以下。

2.3激素組成對瓦松外植體啟動培養(yǎng)的影響

初代培養(yǎng)中以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，培養(yǎng)基中添加不同的濃度NAA和6-BA，瓦松外植體的啟動培養(yǎng)結果如表2和圖3所示。

從表2可以看出，瓦松的腋芽最早在接種1周后才開始萌動。腋芽的萌動時間受培養(yǎng)基中激素配比的影響而不同：培養(yǎng)基僅含有NAA時，芽的初始萌動時間隨NAA濃度的增加而延長，在NAA濃度為0.5 mg/L時，接種后30 d，沒有觀察到腋芽萌動；僅含有6-BA的培養(yǎng)基，隨6-BA濃度的增加，腋芽萌生時間也明顯延遲，6-BA濃度為1.0 mg/L時，接種后30 d同樣也沒有發(fā)現(xiàn)腋芽萌動；當NAA和6-BA同時存在于培養(yǎng)基中，在培養(yǎng)基中6-BA濃度為0.1 mg/L，NAA濃度為0.1、0.3 mg/L時，瓦松腋芽萌動的時間都明顯提早；培養(yǎng)基中6-BA濃度提高為 0.5 mg/L，無論培養(yǎng)基中NAA濃度是高是低，瓦松腋芽萌動的初始時間都明顯提前，最早接種后8 d腋芽開始萌動；當培養(yǎng)基中NAA濃度為0.5 mg/L，6-BA 濃度為0.1、1.0 mg/L時，接種后30 d均沒有觀察到瓦松腋芽的萌發(fā)；培養(yǎng)基中不添加任何激素，腋芽初始萌生時間為接種后20 d。瓦松外植體在不同的培養(yǎng)基中，其腋芽的初始萌生時間呈現(xiàn)不同，這可能與所添加生長調節(jié)劑的特性有關：NAA是生長素類物質，能明顯促進材料體內細胞的生長，它在低濃度時，可以促進材料不定根產生；濃度較高時，則會產生愈傷組織，抑制芽的發(fā)生。6-BA為細胞分裂素類物質，能促進細胞分裂，促進不定芽和叢生芽的形成；過高濃度時，會出現(xiàn)玻璃化等不良現(xiàn)象，抑制芽的發(fā)生。

另外，瓦松腋芽的啟動率在添加一種激素的培養(yǎng)基中隨添加激素濃度的增加而降低；在同時添加2種激素的培養(yǎng)基中，在6-BA濃度為0.1、0.5 mg/L時，隨NAA濃度的提高，芽啟動率降低；當6-BA濃度為 1.0 mg/L 時，NAA濃度過低（0.1 mg/L）或過高（0.5 mg/L）出現(xiàn)腋芽啟動率反而沒有 0.5 mg/L 的芽啟動率高；培養(yǎng)基中不添加任何激素，瓦松的腋芽也全部萌發(fā)，芽萌發(fā)后生長緩慢，沒有根系發(fā)生（表2）。

對各處理進行顯著性分析發(fā)現(xiàn)，不同處理間達到顯著水平，處理組合7（A2B3）和處理組合5（A2B1）極顯著高于其他組合，處理組合16（A4B4）、13（A4B1）、4（A1B4）最差，處理組合8（A2B4）、14（A4B2）效果也比較差。

綜合外植體接種后的萌生速度、啟動率、生理狀態(tài)等基本表現(xiàn)，瓦松初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基以MS+NAA0.1mg/L+6-BA表2不同激素配比對瓦松外植體啟動培養(yǎng)的影響

3小結與討論

材料消毒是建立植物組織培養(yǎng)無菌再生體系的第一步，它直接關系到無菌體系能否建立，因此格外關鍵。許多研究指出，不同的植物種類、外植體類型、不同的生理狀態(tài)及取材季節(jié)，所采用的外植體處理和消毒方式均不相同[10-14]。朱淑穎等在研究野生草珊瑚快繁體系建立時，發(fā)現(xiàn)直接使用消毒劑對外植體材料進行消毒，初代培養(yǎng)的污染率幾乎為100%，其指出，選取的外植體材料源自野外的植株，葉表面孳生著大量微生物，并附著大量的霉菌孢子和細菌芽孢，甚至一些菌絲體進入表皮薄壁細胞，直接消毒難以奏效[10]。王麗萍等在進行番木瓜組織培養(yǎng)時，指出以大田番木瓜作外植體，很難控制污染，如果在番木瓜外植體使用消毒劑前用熱水進行浸泡處理10 min，污染率同比降低了28.62%[11]。德慶措姆以西藏林芝地區(qū)野生銀白楊萌蘗苗為材料，研究銀白楊的消毒技術時發(fā)現(xiàn)，其體表密被白絨毛，直接影響消毒劑的滲入和減低消毒效果[12]。宋會訪研究桂花的植物組織培養(yǎng)時，發(fā)現(xiàn)桂花莖段腋芽表面吸附大量雜菌，且枝條內部有內生菌存在，消毒難以控制，而新生的枝條和葉片中雜菌較少，容易消毒處理[13]。王延玲等在仙客來花藥培養(yǎng)中，同樣也指出材料表面的微生物難以消除徹底，不利于消毒處理[14]。本試驗以野生瓦松莖段為外植體材料，比較了直接消毒接種和經(jīng)過假植后剪新萌莖段接種2種處理方式對污染、存活率等的影響，發(fā)現(xiàn)假植后消毒雖能降低污染率，但材料的存活率大幅度下降，這和前人研究基本一致。主要原因是材料表面存在大量微生物，消毒劑難以將有些芽孢孢子殺死，通過假植后選取莖段，則能明顯降低污染率，說明材料暴露空氣中的時間越短，其攜帶微生物含量越少，也驗證了前人的研究[12-15]。

瓦松為2年生植物，野生狀態(tài)下，其生長狀態(tài)受自然環(huán)境制約很大，華北地區(qū)春季3—4月多缺乏雨水，繼而瓦松種子不能很好進行發(fā)芽產生新植株，1年生植株同時也因缺乏水分而生長受限，因此，應結合瓦松的生物學特性和環(huán)境條件來合理取材。馬翠萍在1年中1月、3月、6月、9月、11月等5個時期分別對冬棗、一品紅、楊樹、櫻桃、草莓進行取材研究，指出取材時應注意避免高溫季節(jié)和材料的休眠期，盡量根據(jù)材料生物學特性和季節(jié)結合進行選擇[15]，這和本試驗結果基本相同。郭曉東以桃樹1年生萌蘗和當年生上部枝條為試材，研究了3月、8月和11月取材對污染的影響，發(fā)現(xiàn)11月污染率最低、8月最高，但材料的啟動率卻以8月最高、11月

最低，綜合分析以3月外植體作為材料最好[16]，這也說明瓦松的取材在考慮季節(jié)因素和生物學特性時，應結合試管苗的生理狀態(tài)來判定最佳的取材時期。

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