本生煙草愈傷組織的誘導(dǎo)和再生體系的建立

陸玉建　劉俊華　王書平　高春明　劉曉君　任宇靈

摘要：以本生煙草為材料，研究了不同激素組合對(duì)本生煙草愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的影響。結(jié)果表明：當(dāng)本生煙草葉片在MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L KT培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，其出愈率最高，愈傷組織生長(zhǎng)狀況最好；在MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中不定芽生長(zhǎng)最快，但存在一定程度的玻璃化現(xiàn)象；MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA培養(yǎng)基中不定芽長(zhǎng)勢(shì)較慢，但玻璃化程度較輕；對(duì)于生根誘導(dǎo)，MS、1/2MS培養(yǎng)基都可誘導(dǎo)不定根的產(chǎn)生，但NAA對(duì)根的生長(zhǎng)更有效。

關(guān)鍵詞：本生煙草；愈傷組織；不定芽；誘導(dǎo)；再生體系

中圖分類號(hào)： S572.043；Q943.1文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）01-0052-03

收稿日期：2013-05-17

基金項(xiàng)目：山東省自然科學(xué)基金（編號(hào)：ZR2012CL14）；濱州學(xué)院博士基金（編號(hào)：2010Y08）。

作者簡(jiǎn)介：陸玉建（1979—），男，河南南陽人，博士，講師，研究方向?yàn)橹参锷锛夹g(shù)。Tel：（0543）3190096；E-mail：luyujian79@163.com。煙草是重要的經(jīng)濟(jì)作物，常被作為基因工程和分子生物學(xué)研究中重要的模式植物[1-5]。目前煙草遺傳轉(zhuǎn)化研究多用普通煙草（Nicotiana tabacum）作為受體，而對(duì)本生煙草（Nicotiana benthamiana）的研究相對(duì)較少。本生煙草和普通煙草有密切的親緣關(guān)系[6-7]，由于其植株矮小，生長(zhǎng)速度快，生命周期短，對(duì)植物病毒非常敏感，所以是基因功能分析和植物病害研究的重要工具[4-8]。有關(guān)本生煙草轉(zhuǎn)基因的研究也見諸報(bào)道，通過在本生煙草中瞬時(shí)表達(dá)促紅細(xì)胞生成素基因，能夠生產(chǎn)重組蛋白-促紅細(xì)胞生成素[9]。利用本生煙草建立的質(zhì)體轉(zhuǎn)化系統(tǒng)，可以用來研究質(zhì)體和細(xì)胞核基因間的相互作用，以及檢測(cè)質(zhì)體中相關(guān)基因的表達(dá)情況[7]。研究表明，不同煙草品種的組織培養(yǎng)條件有所區(qū)別，如果完全按照普通煙草的培養(yǎng)方法培養(yǎng)本生煙草，容易出現(xiàn)外植體褐化、不定芽玻璃化等現(xiàn)象，并且很難獲得再生植株[4-5]。激素是植物組織培養(yǎng)中的關(guān)鍵因素，在建立本生煙草再生體系的整個(gè)培養(yǎng)過程中，激素的使用起到了非常重要的作用[4-5，10]。因此，如何獲得最佳的激素組合，成為建立本生煙草高效再生體系的關(guān)鍵。本研究探索了本生煙草愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的最佳條件，旨在為建立高效的本生煙草懸浮細(xì)胞培養(yǎng)體系和遺傳轉(zhuǎn)化體系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料和生長(zhǎng)條件

本生煙草種子由濱州學(xué)院生命科學(xué)系實(shí)驗(yàn)室保存，本生煙草生長(zhǎng)條件為：每天16 h光照、8 h黑暗，濕度保持在60%～70%，溫度控制在25 ℃左右，光照強(qiáng)度為2 200 lx。

1.2方法

1.2.1種子消毒和無菌苗獲得將本生煙草種子用0.1%氯化汞溶液消毒10 min，無菌水漂洗5～6次，接種到MS基本培養(yǎng)基中培養(yǎng)。

1.2.2培養(yǎng)基配制培養(yǎng)基的配制方法見表1。所有培養(yǎng)基中均添加3%蔗糖和0.8%瓊脂。不定芽增殖培養(yǎng)基為MS基本培養(yǎng)基。

表1不同培養(yǎng)基的組成

培養(yǎng)基類型1編號(hào)1激素組合愈傷組織誘導(dǎo)1R11MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT1R21MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L KT1R31MS+1.0 mg/L 2，4-D+0.2 mg/L KT1R41MS+2.0 mg/L 2，4-D+0.5 mg/L KT不定芽誘導(dǎo)1y11MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA1y21MS+3.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA1y31MS +1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA1y41MS+3.0 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA生根誘導(dǎo)1yc111/2MS+0.1 mg/L IBA1yc21MS+0.1 mg/L IBA1yc311/2MS+0.1 mg/L NAA1yc41MS+0.1 mg/L NAA

1.2.3結(jié)果觀測(cè)與統(tǒng)計(jì)方法外植體接種30 d后進(jìn)行增殖培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)出愈率、不定芽分化率、生根率。有關(guān)計(jì)算公式如下：

出愈率=（產(chǎn)生愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%；

不定芽分化率=（產(chǎn)生不定芽的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%；

生根率=（產(chǎn)生不定根的外植體數(shù)/接種的外植體數(shù)）×100%。

2結(jié)果與分析

2.1愈傷組織的誘導(dǎo)

以生長(zhǎng)30 d的無菌苗葉片為外植體，接種到愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中（圖1-A）。在接種后第10天可以觀察到本生煙草葉片發(fā)生明顯卷曲，在葉片邊緣產(chǎn)生肉眼可見的乳白色顆粒狀愈傷組織（圖1-B）。繼續(xù)培養(yǎng)至22 d時(shí)，在葉片上形成了成團(tuán)的愈傷組織，結(jié)構(gòu)疏松，生長(zhǎng)十分旺盛（圖1-C）。

2.2不定芽的形成

本生煙草葉片接種到不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中12 d后，葉片邊緣出現(xiàn)少量深綠色芽點(diǎn)（圖1-D）。接種后第 26天芽點(diǎn)已經(jīng)形成明顯的不定芽（圖1-E）。

2.3生根誘導(dǎo)

切取不定芽，接種到生根培養(yǎng)基中培養(yǎng)（圖1-F）。在生根誘導(dǎo)的第12天可以看到不定芽基部已形成明顯的根（圖1-G）。最后選取生長(zhǎng)旺盛的試管苗進(jìn)行馴化和移栽（圖1-H）。

2.4激素對(duì)愈傷組織誘導(dǎo)的影響

為了研究不同激素組合對(duì)本生煙草愈傷組織誘導(dǎo)的影響，分別對(duì)不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中葉片愈傷組織的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察分析。結(jié)果顯示，在葉片接種后的第30天，雖然這4種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織，并且誘導(dǎo)率幾乎都為100%，但產(chǎn)生愈傷組織的數(shù)量和質(zhì)量存在差異。R3培養(yǎng)基中產(chǎn)生愈傷組織的質(zhì)量最好，愈傷組織色澤均勻而透明，生長(zhǎng)迅速，堆積的團(tuán)塊明顯較大（圖2-C）；雖然R4培養(yǎng)基中產(chǎn)生愈傷組織的數(shù)量較多，但質(zhì)量有所下降（圖2-D）；R1、R2培養(yǎng)基也能誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生愈傷組織，但愈傷組織的誘導(dǎo)效果相對(duì)較差，尤以R1表現(xiàn)的更為明顯（圖2-A、圖2-B）。上述結(jié)果表明，1 mg/L 2，4-D和0.2 mg/L KT為誘導(dǎo)本生煙草愈傷組織的最佳激素組合，這時(shí)本生煙草葉片細(xì)胞脫分化的能力最強(qiáng)，細(xì)胞分裂最為旺盛。

2.5激素對(duì)不定芽誘導(dǎo)的影響

為了獲得本生煙草不定芽誘導(dǎo)的最佳激素組合，分別對(duì)不同誘導(dǎo)培養(yǎng)基中葉片不定芽的生長(zhǎng)情況進(jìn)行觀察分析。結(jié)果顯示，在葉片接種后第30天，雖然這4種培養(yǎng)基均可誘導(dǎo)葉片產(chǎn)生不定芽，但不定芽產(chǎn)生的數(shù)量和速度存在差異。y1培養(yǎng)基中不定芽產(chǎn)生最早、生長(zhǎng)最快、數(shù)量最多（圖2-E）；與y1培養(yǎng)基相比，y2培養(yǎng)基誘導(dǎo)產(chǎn)生不定芽的時(shí)間有所延長(zhǎng)，不定芽生長(zhǎng)速度稍慢，數(shù)量略有下降（圖2-F）。在y1、y2培養(yǎng)基中，不定芽分化率都在90%以上。y4培養(yǎng)基中不定芽生長(zhǎng)較為緩慢（圖2-H），不定芽分化率大概為80%；y3培養(yǎng)基中不定芽長(zhǎng)勢(shì)最差（圖2-G），不定芽分化率僅為60%左右。此外觀察發(fā)現(xiàn)，在y1、y2培養(yǎng)基中許多不定芽呈半透明的水浸狀，表現(xiàn)出明顯的玻璃化現(xiàn)象，并且培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，這種現(xiàn)象越明顯。但在y4培養(yǎng)基中不定芽并沒有表現(xiàn)出明顯的玻璃化。根據(jù)以上結(jié)果，可以認(rèn)為不定芽誘導(dǎo)最適培養(yǎng)基為y1培養(yǎng)基，但須要在不定芽產(chǎn)生早期進(jìn)行增殖培養(yǎng)，以減少玻璃化的發(fā)生；y4培養(yǎng)基則適于不定芽的長(zhǎng)期培養(yǎng)。

3結(jié)論與討論

植物激素是植物細(xì)胞生長(zhǎng)最適宜的調(diào)節(jié)物質(zhì)[11]。生長(zhǎng)素常用來誘導(dǎo)愈傷組織的形成和根的分化[11-13]；細(xì)胞分裂素的主要生理作用是促進(jìn)細(xì)胞分裂、誘導(dǎo)芽的形成、促進(jìn)芽的生長(zhǎng)[11，13]。2，4-D對(duì)啟動(dòng)植物細(xì)胞脫分化十分重要，研究表明隨著2，4-D濃度的增大，植物愈傷組織的誘導(dǎo)能力逐漸增強(qiáng)，但超過一定濃度時(shí)，反而對(duì)愈傷組織的誘導(dǎo)起抑制作用。本研究表明，本生煙草愈傷組織誘導(dǎo)的最適2，4-D濃度為1 mg/L，該條件下本生煙草葉片細(xì)胞脫分化的能力最強(qiáng)，細(xì)胞分裂最為旺盛。

KT是一種細(xì)胞分裂素，能促進(jìn)脫分化的細(xì)胞保持旺盛的分裂能力，因此在培養(yǎng)基中添加低濃度KT有助于愈傷組織生長(zhǎng)和增殖，但KT濃度不宜過高，否則會(huì)對(duì)細(xì)胞分裂起抑制作用。對(duì)于本生煙草而言，比較合適的KT濃度為0.2 mg/L。在不定芽誘導(dǎo)過程中，6-BA 和NAA是2種關(guān)鍵成分，它們之間必須維持一個(gè)合適比例。當(dāng)6-BA、NAA濃度分別為15、0.1 mg/L時(shí)，不定芽產(chǎn)生較多，生長(zhǎng)速度較快，但存在一定程度的玻璃化現(xiàn)象；當(dāng)6-BA濃度達(dá)到3.0 mg/L，不定芽長(zhǎng)勢(shì)較慢，但玻璃化程度較輕?？梢?，適當(dāng)提高6-BA濃度在一定程度上可減少不定芽玻璃化的產(chǎn)生，這和蘇上等的研究結(jié)果一致[4]，而和崔海濤等的研究結(jié)果稍有不同[5]。在本生煙草培養(yǎng)過程中，極易產(chǎn)生玻璃化現(xiàn)象，導(dǎo)致試管苗分化能力降低[14-15]。為了減少試管苗的玻璃化，一種方法是適當(dāng)提高6-BA濃度，但不定芽產(chǎn)生數(shù)量較少；另一種方法是在 6-BA 濃度較低的情況下，先誘導(dǎo)產(chǎn)生較多的不定芽，然后在不含激素的培養(yǎng)基中及時(shí)進(jìn)行繼代增殖培養(yǎng)，這樣可以降低不定芽出現(xiàn)玻璃化的概率。綜上，為了得到更多的不定芽，比較適宜的激素組合為1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA，但須要在不定芽形成早期及時(shí)進(jìn)行增殖培養(yǎng)。

對(duì)于生根誘導(dǎo)，無論是MS培養(yǎng)基還是1/2MS培養(yǎng)基，都可誘導(dǎo)不定根的產(chǎn)生；相比之下，在含0.1 mg/L NAA的培養(yǎng)基中，不定根長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)較好，根系比較旺盛。

本生煙草具有普通煙草無可比擬的優(yōu)點(diǎn)，已成為生命科學(xué)基礎(chǔ)理論研究中十分重要的模式植物。本研究探索了本生煙草愈傷組織誘導(dǎo)和再生體系建立的最適條件，對(duì)于今后進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)和次生代謝物生產(chǎn)，植物遺傳轉(zhuǎn)化和性狀改良都具有一定參考價(jià)值。

參考文獻(xiàn)：

[1]肖軍，張?jiān)葡?，劉伯? 煙草的組織培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 泰山學(xué)院學(xué)報(bào)，2009，31（6）：94-98.

[2]周仕順，掏志章. 煙草的組織培養(yǎng)[J]. 云南農(nóng)業(yè)科技，2005（1）：22.

[3]朱生偉，徐仲，朱祥春，等. 煙草葉組織培養(yǎng)再生系統(tǒng)的建立[J]. 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1998，20（1）：30-32.

[4]蘇上，張旋，馮思思，等. 本生煙草組培再生及遺傳轉(zhuǎn)化的研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（20）：10530-10531，10607.

[5]崔海濤，李春霞，王紅艷，等. 本生煙組織培養(yǎng)及遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[J]. 山東科學(xué)，2006，19（1）：23-27.

[6]Goodin M M，Zaitlin D，Naidu R A，et al. Nicotiana benthamiana：its history and future as a model for plant-pathogen interactions[J]. Molecular Plant-Microbe Interactions，2008，21（8）：1015-1026.

[7]Davarpanah S J，Jung S H，Kim Y J，et al. Stable plastid transformation in Nicotiana benthamiana[J]. Journal of Plant Biology，2009，52（3）：244-250.

[8]Baulcombe D C. Fast forward genetics based on virus-induced gene silencing[J]. Current Opinion in Plant Biology，1999，2（2）：109-113.

[9]Moon K B，Jeon J H，Lee W S，et al. Transient erythropoietin overexpression with cucumber Mosaic virus suppressor 2b in Nicotiana benthamiana[J]. Hort Environ Biotechnol，2012，53（5）：434-440.

[10]陳名紅，李天飛，陳學(xué)軍. 培養(yǎng)基及植物激素對(duì)煙草原生質(zhì)體再生植株的影響[J]. 種子，2005，24（9）：76-79.

[11]楊淑慎. 細(xì)胞工程[M]. 北京：科學(xué)出版社，2009：23-28.

[12]崔麗華. 植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)對(duì)組織培養(yǎng)中不定芽不定根的作用[J]. 遼寧師專學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2000（2）：97-99.

[13]王慧英. 影響植物愈傷組織形成的因素研究[J]. 聊城大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2010，23（2）：51-53.

[14]陳兵先，黃寶靈，呂成群，等. 植物組織培養(yǎng)試管苗玻璃化現(xiàn)象研究進(jìn)展[J]. 林業(yè)科技開發(fā)，2011，25（1）：1-5.

[15]郭艷茹，詹亞光. 植物離體快繁中的常見問題及防止措施[J]. 黑龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（1）：19-21.李慶偉，梁明勤，樊亞敏，等. 不同取材時(shí)期和處理方法對(duì)瓦松無菌體系建立的影響[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（1）：55-58.