Lgr5在慢性淺表性胃炎中的表達(dá)*

周小嬪， 王佐妤， 劉彩紅， 謝立群

(武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，天津 300162)

Lgr5在慢性淺表性胃炎中的表達(dá)*

周小嬪， 王佐妤， 劉彩紅， 謝立群△

(武警后勤學(xué)院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，天津 300162)

目的： 探討富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5(Lgr5)在慢性淺表性胃炎中的表達(dá)及其臨床意義。方法: 將30只Wistar大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組和對(duì)照組。采用0.02%氨水合并饑飽失常法對(duì)大鼠進(jìn)行慢性淺表性胃炎造模，模型復(fù)制成功后，采用免疫組化、Western blotting和RT-PCR檢測(cè)各組中Lgr5的mRNA及蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果: Lgr5主要在細(xì)胞的胞膜和胞漿中表達(dá)，模型組中Lgr5 mRNA和蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組和空白組大鼠(P<0.01)，對(duì)照組和空白組中Lgr5表達(dá)水平差異不顯著(P>0.05)。結(jié)論: 持續(xù)的炎癥刺激導(dǎo)致Lgr5表達(dá)增加，Lgr5可能是一種炎性的促腫瘤因子。

Lgr5蛋白； Wnt信號(hào)通路； 慢性淺表性胃炎

富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5(leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5, Lgr5)又名GPR49，是一種G蛋白偶聯(lián)受體，是Wnt信號(hào)通路的一種靶基因，還是一種潛在的人類腸干細(xì)胞標(biāo)志物[1-3]。已有研究表明Lgr5在人類不同腫瘤的發(fā)生中起重要作用，包括肝癌、基底細(xì)胞癌、結(jié)腸癌、卵巢癌和食管癌等等[4-7]。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)Lgr5與胃癌的發(fā)生發(fā)展也十分密切。慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis, CSG)是多種誘因引起的慢性胃黏膜炎癥，由攻擊因子和/或防御因子失衡所導(dǎo)致部分淺表性胃炎，屬于消化系統(tǒng)的常見(jiàn)病、多發(fā)病之一[8]。其失于治療極易進(jìn)展為慢性萎縮性胃炎繼而發(fā)生癌變。本研究主要觀察大鼠慢性淺表性胃炎胃組織中Lgr5表達(dá)的變化，從而在早期發(fā)現(xiàn)其與胃癌發(fā)展的相關(guān)性，起到早期發(fā)現(xiàn)并預(yù)防胃癌的進(jìn)一步發(fā)展。

材 料 和 方 法

1 試劑

TRIzol試劑(Invitrogen)；RT-PCR試劑盒(TransGen)；β-actin抗體(中國(guó)博奧森公司)；Lgr5抗體(Epitomics)；II抗(Abgent)。

2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

將30只成年雄性7周齡Wistar大鼠編號(hào)，稱重，按隨機(jī)數(shù)字表順序分為3組、即空白(blank)組，對(duì)照(control)組和模型(model)組，每組10只。

3 主要方法

3.1 建立動(dòng)物模型 參照王睿琦等[9]研究的慢性淺表性胃炎造模法，空白組的動(dòng)物不做任何處理，正常飼養(yǎng)，自由飲水；對(duì)照組的大鼠正常飼養(yǎng)，并給予0.9%生理鹽水每日自由飲用；模型組的大鼠0.02%氨水自由飲用(現(xiàn)配)，饑飽失常(進(jìn)食2 d，禁食1 d)。所有大鼠飼養(yǎng)6個(gè)月。

3.2 RT-PCR 模型復(fù)制成功后，每組取6只大鼠麻醉處死，無(wú)菌條件下取胃竇組織，用TRIzol法提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。利用Pubmed-blast設(shè)計(jì)目的基因引物(引物由北京鼎國(guó)生物科技公司合成)。Lgr5和內(nèi)參照β-actin基因的引物序列見(jiàn)表1。RT-PCR反應(yīng)條件為95 ℃5 min，94 ℃30 s、59 ℃30 s、72 ℃45 s，共35個(gè)循環(huán)。產(chǎn)物行2%瓊脂糖凝膠電泳，用捷達(dá)圖像分析系統(tǒng)捕獲圖像并用灰度掃描分析結(jié)果。

表1 RT-PCR引物序列

3.3 Western blotting檢測(cè) 模型復(fù)制成功后取材，每100 mg組織樣本加入100 μL裂解液，充分研磨后于冰上裂解10 min， 12 000 r/min離心10 min，取上清液。BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度后，取60 μg蛋白樣本，經(jīng)SDS-PAGE分離后轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，脫脂奶粉封閉1 h，加入Lgr5的 I 抗，4 ℃過(guò)夜，洗膜后加II抗，37 ℃孵育1 h。使用ECL液顯色，最后進(jìn)行顯影、定影，用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)掃描吸光度值，用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行分析。定量結(jié)果應(yīng)用GraphPad Prism 6.0統(tǒng)計(jì)軟件作圖。

3.4 HE染色 造模成功后，將大鼠麻醉處死，取胃竇組織置于10%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片放在60 ℃烘箱中烘烤30 min，常規(guī)脫蠟，流水沖洗10 min后，蘇木素染色3 min。隨后用流水沖洗10 min，伊紅復(fù)染2 min，流水沖洗10 min，乙醇脫水，二甲苯2次透明，中性樹膠封固。每張切片在200倍顯微鏡下隨機(jī)選擇4個(gè)視野進(jìn)行觀察。

3.5 免疫組織化學(xué)染色 造模成功后，應(yīng)用兔超敏二步法免疫組化試劑盒行免疫組化染色，大鼠胃組織切片用3%的H2O2封閉10 min后，用pH 6.0的枸櫞酸溶液加熱孵育15 min行抗原修復(fù)。冷卻至室溫后用5 %的山羊血清37 ℃封閉30 min。滴加Lgr5的Ⅰ抗(工作濃度1∶150)，4 ℃過(guò)夜。PBS清洗后滴加II抗37 ℃孵育45 min。PBS清洗后DAB顯色劑顯色，沖洗，蘇木素復(fù)染，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹脂封片。在Nikon偏振光倒置顯微鏡下觀察免疫陽(yáng)性反應(yīng)物的分布與定位。隨機(jī)選取5個(gè)不重復(fù)視野，鏡下計(jì)數(shù)形態(tài)完整的Lgr5陽(yáng)性細(xì)胞，計(jì)算各組的平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析(ANOVA)，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 Lgr5 mRNA表達(dá)的變化

與空白組相比，模型組Lgr5 mRNA表達(dá)量增加3.53倍，兩者差異顯著(P<0.01)，而空白組和對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖1。

Figure 1.The mRNA expression of Lgr5 determined by RT-PCR. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank and control groups.

圖1 Lgr5 mRNA的 表達(dá)

2 Lgr5蛋白的表達(dá)變化

經(jīng)Western blotting實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在蛋白水平驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)模型組中的Lgr5蛋白表達(dá)(23.5±0.7)較空白組(12.5±0.6)明顯增高，兩者差異顯著(P<0.01)，但空白組和對(duì)照組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)圖2。

Figure 2.The protein expression of Lgr5 determined by Western blotting. Mean±SD.n=6.**P<0.01vsblank and control groups.

圖2 Lgr5 蛋白的表達(dá)

3 HE染色結(jié)果胃竇組織的病理變化

空白組和對(duì)照組胃組織未見(jiàn)異常改變，模型組胃竇黏膜固有膜、黏膜肌及黏膜下見(jiàn)炎細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖3。

4 Lgr5免疫陽(yáng)性產(chǎn)物染色結(jié)果

Lgr5陽(yáng)性產(chǎn)物主要定位于細(xì)胞的胞質(zhì)和胞漿中，空白組和對(duì)照組免疫陽(yáng)性產(chǎn)物表達(dá)量較低，模型組(224±11)較空白組(76±5)和對(duì)照組(81±3)表達(dá)量明顯增加(P<0.05)，見(jiàn)圖4。

討 論

Lgr5是具有18個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)單位和7個(gè)跨膜區(qū)域組成的大分子蛋白,是G蛋白偶聯(lián)受體家族的成員之一，Lgr5在人體分布廣泛，在大腦、脊髓、乳腺、毛囊、眼睛、生殖器官及胃腸道等都有表達(dá)[1，10-13]。

Figure 3.The gastric pathological changes in the 3 groups.

圖3 各組大鼠胃組織的病理改變

Figure 4.The protein expression of Lgr5 in gastric tissues (immunohistochemistry staining).

圖4 各組大鼠胃組織的Lgr5表達(dá)

Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路可影響和調(diào)控干細(xì)胞的自我更新和分化，在細(xì)胞增殖、分化、運(yùn)動(dòng)及凋亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其異常表達(dá)或激活能引起腫瘤。經(jīng)典的Wnt轉(zhuǎn)導(dǎo)通路(Wnt/β-catenin)是Wnt蛋白與卷曲蛋白受體(Fizzled)結(jié)合，使活化的Fizzled作用于細(xì)胞漿的蓬亂蛋白，從而抑制由軸蛋白、腸腺瘤樣息肉蛋白和糖原合成激酶GSK-3β組成的復(fù)合物的活性，使β-catenin不能被GSK-3β磷酸化。由于非磷酸化的β-catenin不能被蛋白酶體降解，從而導(dǎo)致β-catenin在胞漿內(nèi)積聚，并移向核內(nèi)。與轉(zhuǎn)錄因子TCF/LEF結(jié)合，激活TCF轉(zhuǎn)錄活性，調(diào)節(jié)Wnt靶基因的表達(dá)[14-15]。

Wnt信號(hào)通路都對(duì)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后起著關(guān)鍵性的作用，而Lgr5 不僅是Wnt信號(hào)通路的靶基因，而且在多種腫瘤組織中高表達(dá)，F(xiàn)an等[16]采用免疫組織化學(xué)法在結(jié)腸癌組織中發(fā)現(xiàn) Lgr5與β-catenin在結(jié)腸癌組織中高表達(dá)并且呈正相關(guān), 由此推斷Lgr5可能通過(guò)Wnt/β-catenin通路參與結(jié)腸癌的發(fā)生。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)Lgr5在胃癌組織中也過(guò)度表達(dá)并伴有β-catenin核表達(dá)，Wnt通路異常激活引起靶基因Lgr5表達(dá)增高與胃癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。Lgr5在各種腫瘤中過(guò)度表達(dá)，所以推測(cè)Lgr5是多種不同腫瘤干細(xì)胞標(biāo)記物。Wnt通路不光與腫瘤相關(guān)，還參與一些炎癥反應(yīng)。Sen等[17]和Polzer等[18]證實(shí)Wnt信號(hào)參與一些慢性炎癥疾病，如風(fēng)濕樣關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化。有研究[19]表明損傷能驅(qū)動(dòng)內(nèi)源性Wnt通路, 激活Wnt信號(hào)參與損傷組織的修復(fù)、愈合和再生。慢性淺表性胃炎是慢性胃炎中的一種，消化系統(tǒng)多發(fā)病之一。部分淺表性胃炎不引起重視極易進(jìn)展為慢性萎縮性胃炎而致胃癌發(fā)生，持續(xù)炎癥可導(dǎo)致細(xì)胞微環(huán)境改變，干細(xì)胞長(zhǎng)期積累突變，使得生物學(xué)行為永久性改變，最終導(dǎo)致腫瘤發(fā)生，干細(xì)胞和炎癥均與胃癌的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。我們主要想研究發(fā)現(xiàn)Lgr5在部分慢性淺表性胃炎中表達(dá)情況，在本研究中發(fā)現(xiàn)模型組大鼠胃組織中Lgr5蛋白及基因表達(dá)水平都高于正常組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。長(zhǎng)時(shí)間刺激藥物灌胃對(duì)大鼠胃組織造成持續(xù)的炎癥刺激,持續(xù)的炎癥可能激活Wnt經(jīng)典信號(hào)通路,而Lgr5又是Wnt通路的靶基因,從而引起Lgr5表達(dá)增加。所以我們推測(cè)Lgr5也可能為一種炎性促腫瘤重要因子。

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Expression of Lgr5 in chronic superficial gastritis

ZHOU Xiao-pin, WANG Zuo-yu, LIU Cai-hong, XIE Li-qun

(DepartmentofGastroenterology,AffiliatedHospitalofLogisticsCollegeofChineseArmedPoliceForces,Tianjin300162,China.E-mail:xieliqun66@hotmail.com)

AIM: To investigate the expression and significance of Leucine-rich repeat-containing G-protein-coupled receptor 5 (Lgr5) in chronic superficial gastritis. METHODS: The Wistar rats (n=30) were randomly divided into blank group, model group and control group. The Wistar rat model of chronic superficial gastritis was established by intragastric administration of 0.02% ammonia and long-term irregular diet. All rats were sacrificed， and gastric tissues were harvested and stained with hematoxylin and eosin. The expression of Lgr5 at mRNA and protein levels was analyzed by reverse transcriptional polymerase chain reaction, Western blotting and immunohistochemistry. RESULTS: Lgr5 was mainly expressed in the cell membrane and cytoplasm. Lgr5 showed high expression in model group compared with blank group and control group. No obvious difference between blank group and control group was observed. CONCLUSION: Persistent inflammation leads to increased expression of Lgr5. Lgr5 may be a proinflammatory tumor promoting factor.

Lgr5 protein; Wnt signaling pathway; Chronic superficial gastritis

1000- 4718(2014)12- 2272- 04

2014- 06- 03

2014- 10- 15

武警后勤學(xué)院院級(jí)科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. WHM201311)

R573.3+1

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.028

△通訊作者Tel: 022-60578661; E-mail: xieliqun66@hotmail.com