CD147對前列腺癌PC-3細(xì)胞自噬的影響*

方 芳， 馮 淳， 姚 楊， 馬瀟瀟， 王立國

(1吉林醫(yī)藥學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 吉林 132013； 2吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

CD147對前列腺癌PC-3細(xì)胞自噬的影響*

方 芳1， 馮 淳1， 姚 楊1， 馬瀟瀟1， 王立國2△

(1吉林醫(yī)藥學(xué)院免疫學(xué)教研室，吉林 吉林 132013； 2吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院，吉林 吉林 132011)

目的： 研究白細(xì)胞分化抗原(CD)147在體外對前列腺癌PC-3細(xì)胞的自噬作用。方法: 通過氨基酸饑餓法建立自噬模型，免疫印跡技術(shù)檢測CD147的表達(dá)。利用RNA干擾CD147表達(dá)的細(xì)胞系，免疫印跡技術(shù)檢測自噬蛋白LC3-I和LC3-II的表達(dá)；臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的死亡情況。結(jié)果: 在PC-3細(xì)胞自噬模型中，隨著饑餓誘導(dǎo)時(shí)間延長，CD147表達(dá)逐漸升高。用RNA干擾技術(shù)降低CD147表達(dá)后，與陰性對照組比較，在自噬模型中CD147干擾組自噬相關(guān)蛋白LC3-II表達(dá)增多；并且細(xì)胞死亡數(shù)量明顯增加，陰性對照組細(xì)胞死亡率分別為(19.3±3.1)%和(22.3±3.5)%，而在CD147干涉組細(xì)胞死亡率為(38.4±3.1)%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論: 在前列腺癌PC-3細(xì)胞中CD147抑制饑餓誘導(dǎo)的自噬，減少自噬性細(xì)胞死亡的發(fā)生。

抗原, CD147； PC-3細(xì)胞； 自體吞噬

自噬是細(xì)胞內(nèi)衰老或受損的細(xì)胞器或長壽命蛋白被包裹運(yùn)送到溶酶體降解的過程，通過自噬實(shí)現(xiàn)自我更新和維持穩(wěn)態(tài)的一個(gè)重要機(jī)制。CD147在前列腺癌細(xì)胞中表達(dá)升高，其作用為抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[1]、促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲[2]、血管生成[3]和參與腫瘤細(xì)胞的能量代謝等[4]。研究表明，CD147在肝癌細(xì)胞中能夠抑制自噬的發(fā)生，防止過度自噬導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，對腫瘤細(xì)胞具有保護(hù)作用[5]。但CD147是否參與前列腺腫瘤細(xì)胞的自噬還不清楚。本研究旨在觀察CD147對前列腺癌細(xì)胞自噬功能的影響，以探討其在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用。

材 料 和 方 法

1 材料和主要試劑

RNA干擾CD147穩(wěn)定表達(dá)前列腺癌PC-3細(xì)胞株由本實(shí)驗(yàn)室保存[6]； DMEM-F12 培養(yǎng)液購自Gibco；胎牛血清購自HyClone；EBSS(Earle’s Balanced Salt Solution)購自Invitrogen；兔抗CD147、LC3 和β-actin抗體購自GeneTex；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；RIPA、PMSF、BSA 和Bradford 法蛋白測定試劑盒均購自江蘇海門市碧云天生物技術(shù)研究所。

2 主要方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 前列腺癌PC-3細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM-F12 培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隔天換液，融合度達(dá)80% 時(shí)傳代。

2.2 前列腺癌饑餓誘導(dǎo)自噬模型建立 細(xì)胞接種到6孔板，37 ℃、5% CO2孵育24 h。細(xì)胞用EBSS緩沖液洗滌2次，加入2 mL EBSS緩沖液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)細(xì)胞建立饑餓缺乏誘導(dǎo)的自噬細(xì)胞模型[7]。

2.3 Western blotting檢測CD147和LC3 蛋白的表達(dá) 取30 μg蛋白SDS-PAGE 凝膠電泳，將凝膠上蛋白移至醋酸纖維素膜，于50 g/L 脫脂奶粉中4 ℃封閉過夜，加兔抗CD147和LC3 抗體(1∶1 000)，小鼠抗β-actin 抗體(1∶3 000)，4 ℃過夜。TBST 洗膜，分別加HRP 標(biāo)記的山羊抗兔抗體(1∶3 000)室溫避光孵育2 h。TBST 洗膜后，加底物發(fā)光顯影。使用Quantity One軟件掃描并做灰度分析。

2.4 細(xì)胞死亡的檢測 將細(xì)胞接種到24孔培養(yǎng)板中，加入EBSS緩沖液37 ℃、5% CO2培養(yǎng)12 h。將培養(yǎng)板中細(xì)胞用消化液消化并離心收集細(xì)胞，取100 μL細(xì)胞懸液，加100 μL 0.8%臺(tái)盼藍(lán)溶液，混勻，每個(gè)樣品至少計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，并重復(fù)3次，藍(lán)色細(xì)胞被記為死亡細(xì)胞，迅速用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 11.0軟件分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示。組間比較行方差分析(ANOVA)，以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 PC-3細(xì)胞自噬模型中CD147的表達(dá)變化

圖1 所示， PC-3細(xì)胞用EBSS饑餓3 h、6 h、9 h、12 h和24 h后，結(jié)果表明隨著饑餓時(shí)間延長，CD147蛋白表達(dá)逐漸升高，提示CD147分子參與饑餓誘導(dǎo)的PC-3細(xì)胞自噬。

2 CD147抑制饑餓誘導(dǎo)細(xì)胞的自噬

細(xì)胞在EBSS中培養(yǎng)12 h后，與陰性對照組PC-3 和PC-3/scrambled細(xì)胞比較，CD147干擾組細(xì)胞LC3-II的表達(dá)顯著提高，LC3-II/LC3-I比值提高(P<0.05),見圖2，提示沉默CD147的表達(dá)后，前列腺癌細(xì)胞自噬顯著增高。

Figure 1.Change of CD147 expression by starvation-induced autophagy in PC-3 cells detected by Western blotting.

圖1 PC-3細(xì)胞饑餓后CD147蛋白表達(dá)的變化

Figure 2.Western blotting analysis of LC-3 protein level in the PC-3 cells with different treatments.Mean±SD.n=3.*P<0.05vsPC-3 or PC-3/scrambled.

圖2 PC-3細(xì)胞LC3蛋白的表達(dá)

3 CD147抑制饑餓誘導(dǎo)自噬性細(xì)胞死亡

細(xì)胞在EBSS培養(yǎng)12 h后結(jié)果表明，陰性對照組PC-3和PC-3/scrambled細(xì)胞死亡率分別為(19.3±3.1)%和(22.3±3.5)%，而在CD147干擾組PC-3/shCD147細(xì)胞死亡率為(38.4±3.1)%，與陰性對照組比較有顯著差異(P<0.05)。這提示在饑餓誘導(dǎo)的自噬中CD147能增強(qiáng)細(xì)胞存活。

討 論

自噬是指細(xì)胞在營養(yǎng)缺乏或應(yīng)激條件下通過消化自身細(xì)胞內(nèi)的蛋白、細(xì)胞器和胞質(zhì)以渡過饑餓的行為，因此自噬被認(rèn)為是細(xì)胞的一種保護(hù)性作用。現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)自噬雖然對細(xì)胞具有保護(hù)作用，但過度的自噬可導(dǎo)致細(xì)胞死亡, 而這被認(rèn)為是區(qū)別于細(xì)胞凋亡( I 型程序性死亡) 的另外一種細(xì)胞程序性死亡形式( II 型程序性死亡)，稱為自噬性細(xì)胞死亡。腫瘤細(xì)胞發(fā)生自噬后會(huì)出現(xiàn)2種不同的結(jié)果: 一種是保護(hù)細(xì)胞防止周圍環(huán)境帶來的損害; 另一種是啟動(dòng)自噬性細(xì)胞死亡程序[8]。目前, 對于這2種不同結(jié)果的產(chǎn)生還沒有發(fā)現(xiàn)特定的規(guī)律。如果可以誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生自噬, 繼而引起細(xì)胞死亡, 可以消除自噬對腫瘤細(xì)胞的保護(hù)作用, 將對腫瘤的治療帶來一個(gè)新的途徑。

CD147是一個(gè)分子量為50～60 kD的單次跨膜糖蛋白，屬于IgSF成員。CD147在黑色素瘤、肝癌、乳腺癌、前列腺癌等多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，參與腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，以及能量代謝和物質(zhì)代謝。現(xiàn)研究表明，CD147在肝癌細(xì)胞中能夠抑制自噬的發(fā)生，防止過度自噬導(dǎo)致的細(xì)胞死亡，對腫瘤細(xì)胞具有保護(hù)作用[8]。因此，CD147 被認(rèn)為是腫瘤發(fā)展進(jìn)程中一個(gè)重要的分子。

為了研究CD147在前列腺癌細(xì)胞中對自噬作用的影響，我們通過RNAi干擾技術(shù)建立的穩(wěn)定低表達(dá)CD147的細(xì)胞系。通過EBSS培養(yǎng)細(xì)胞建立細(xì)胞自噬模型，我們研究發(fā)現(xiàn)隨著饑餓時(shí)間延長，CD147表達(dá)逐漸增高，證明CD147參與了細(xì)胞自噬的發(fā)生。LC3蛋白是酵母自噬相關(guān)蛋白8的同源蛋白，在合成后其C 末端即被酵母自噬相關(guān)蛋白4蛋白酶切割轉(zhuǎn)變?yōu)長C3-Ⅰ并散在分布于細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，當(dāng)自噬被誘導(dǎo)后，LC3-Ⅰ和磷脂酰乙醇胺偶聯(lián)形成LC3-Ⅱ并始終穩(wěn)定地錨定于自噬體膜上直到與溶酶體融合，因此被用來作為自噬體的標(biāo)記，LC3-Ⅰ向LC3-Ⅱ的轉(zhuǎn)變代表了自噬的誘導(dǎo)，且LC3-Ⅱ的水平在某種程度上反映了自噬體的數(shù)量[9]。我們通過Western blotting實(shí)驗(yàn)證明，在CD147干擾組細(xì)胞中LC3-Ⅱ表達(dá)增高，LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比值增加，CD147抑制了饑餓誘導(dǎo)的前列腺癌細(xì)胞自噬。本實(shí)驗(yàn)通過臺(tái)盼藍(lán)排斥實(shí)驗(yàn)檢測了細(xì)胞死亡情況，結(jié)果表明抑制CD1)47的表達(dá)后，在饑餓誘導(dǎo)的自噬模型中細(xì)胞死亡數(shù)量增加。綜上所述， CD147抑制自噬的產(chǎn)生，防止過度自噬導(dǎo)致的腫瘤細(xì)胞死亡，對腫瘤細(xì)胞具有保護(hù)作用。

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CD147 affects autophagy of prostate cancer PC-3 cells

FANG Fang1, FENG Chun1, YAO Yang1, MA Xiao-xiao1, WANG Li-guo2

(1ImmunologyDepartmentofJilinMedicalCollege,Jilin132013,China;2AffiliatedHospitalofJilinMedicalCollege,Jilin132011,China.E-mail:urolancet@sina.com)

AIM: To study the autophagy of prostate cancer PC-3 cells induced by CD147invitro. ME-THODS: The method of amino acid starvation to induce autophagy was used. The expression ofCD147 was detected by Western blotting. To study the functional effects of CD147 on autophagy in prostate cancer PC-3 cells, the down-regulation ofCD147 expression was induced by the technique of RNAi. The conversion of autophagic marker protein LC3-I to LC3-II was determined by Western blotting. The cell death after starvation-induced autophagy was analyzed by trypan blue exclusion assay. RESULTS: The CD147 expression gradually increased in starvation-induced autophagy. The down-regulation of CD147 significantly increased the expression of autophagy-related protein LC3-II compared with control group. Meanwhile, the cell death rates increased from (19.3±3.1)% and (22.3±3.5)% in control groups to (38.4±3.1)% in silencing the expression ofCD147 in the PC-3 cells (P<0.05). CONCLUSION: CD147 inhibits starvation-induced autophgy and autophagy death in the prostate cancer PC-3 cells.

Antigens, CD147; PC-3 cells; Autophagy

1000- 4718(2014)12- 2259- 03

2014- 06- 09

2014- 07- 04

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No. 81202031)；吉林省教育廳“十二五”教育技術(shù)研究項(xiàng)目(吉教科合字2012第333號(hào))；吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃(No.20130101154JC)；吉林省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.201015239)吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究重點(diǎn)項(xiàng)目(No.吉教科合字2013第346號(hào))

R737.25

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.025

△ 通訊作者 Tel: 0432-64560741； E-mail: urolancet@sina.com