美沙拉嗪對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型Th1、Th17及Treg細(xì)胞亞群的影響*

祝 斌， 張寒仙， 曾今誠(chéng)， 安博然， 徐軍發(fā) ， 舒建昌△

(1暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510632； 2廣東醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，廣東 東莞 524808；3廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 湛江 524023； 4廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 東莞 524808)

美沙拉嗪對(duì)DSS誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型Th1、Th17及Treg細(xì)胞亞群的影響*

祝 斌1， 張寒仙2,3， 曾今誠(chéng)2,4， 安博然3， 徐軍發(fā)2,4， 舒建昌1△

(1暨南大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院， 廣東 廣州 510632；2廣東醫(yī)學(xué)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)研究所，廣東 東莞 524808；3廣東醫(yī)學(xué)院，廣東 湛江 524023；4廣東省醫(yī)學(xué)分子診斷重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 東莞 524808)

目的： 觀察葡聚糖硫酸鈉(DSS)誘導(dǎo)小鼠潰瘍性結(jié)腸炎(UC)模型中輔助性T細(xì)胞(Th1、Th17亞群)及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)細(xì)胞亞群的變化，探討美沙拉嗪(MSLZ)治療UC的免疫學(xué)機(jī)制。方法: 采用流式細(xì)胞分析術(shù)檢測(cè)DSS誘導(dǎo)的小鼠UC模型結(jié)腸組織及外周血單個(gè)核細(xì)胞中白細(xì)胞介素17(IL-17)、γ-干擾素(IFN-γ)及核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)，并檢測(cè)MSLZ預(yù)治療對(duì)小鼠UC 模型Th1、Th17和Treg亞群的影響。結(jié)果: 在DSS誘導(dǎo)的小鼠UC模型中，其外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)中CD3+T細(xì)胞高表達(dá)IL-17、IFN-γ及Foxp3，腸黏膜單個(gè)核細(xì)胞(LPMC)中CD3+T細(xì)胞高表達(dá)IFN-γ和Foxp3，但I(xiàn)L-17的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)差異。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)UC模型小鼠LPMC中Th17、Th1和Treg均顯著高于對(duì)照組，但PBMC中只有Treg高于對(duì)照組。MSLZ預(yù)治療能顯著下調(diào)UC 模型小鼠PBMC和LPMC中Th17、Th1和Treg細(xì)胞亞群。結(jié)論: DSS誘導(dǎo)的小鼠 UC模型中CD4+T細(xì)胞亞群Th1、Th17及Treg細(xì)胞顯著升高，提示CD4+T細(xì)胞亞群在UC發(fā)病中起重要作用，美沙拉嗪可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1、Th17及Treg細(xì)胞亞群發(fā)揮抗炎及治療UC作用。

葡聚糖硫酸鈉； 潰瘍性結(jié)腸炎； 美沙拉嗪

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis, UC)是炎癥性腸病的一種，是一類病因不明的以胃腸道慢性非特異性炎癥為主要表現(xiàn)的疾病，近年來(lái)成為消化系統(tǒng)常見(jiàn)的疾病，其主要臨床表現(xiàn)為腹痛與腹瀉[1]。關(guān)于其病因目前大多數(shù)研究認(rèn)為與環(huán)境、遺傳、感染及免疫學(xué)因素相關(guān)，而免疫學(xué)因素被認(rèn)為與UC的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，CD4+T細(xì)胞亞群在UC發(fā)病中尤為重要[2]。本研究通過(guò)檢測(cè)葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium，DSS)誘導(dǎo)的小鼠UC模型結(jié)腸組織及外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD4+T細(xì)胞胞內(nèi)IL-17、IFN-γ和核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)，觀察UC小鼠模型CD4+T細(xì)胞亞群的改變，并研究美沙拉嗪(mesalazine，MSLZ)預(yù)治療對(duì)各CD4+T細(xì)胞亞群的影響，探討UC可能的發(fā)病機(jī)制及美沙拉嗪治療UC的免疫學(xué)機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 實(shí)驗(yàn)材料

無(wú)病原環(huán)境出生的C57BL/6小鼠(6～8周齡)(購(gòu)自廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)。DSS分子量為35 000～40 000，購(gòu)自MP?？剐∈驝D3-PE-Cy7(BioLegend)；抗小鼠CD4- FITC、抗小鼠CD272-APC、抗小鼠 IL-17- PE、抗小鼠 IFN-γ PerCP-Cy5.5和抗小鼠 Foxp3 -PE-Cy5.5均購(gòu)自eBioscience。流式細(xì)胞儀為BD 產(chǎn)品。破膜劑為杭州聯(lián)科生物公司產(chǎn)品。美沙拉嗪為葵花藥業(yè)產(chǎn)品。大便隱血試劑盒為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品。膠原酶II為Sigma產(chǎn)品。

2 UC模型制作與觀察

參閱文獻(xiàn)[3-4]制作UC模型，取小鼠16只，隨機(jī)分為對(duì)照組(Con組)和實(shí)驗(yàn)組(DSS組)，每組8只小鼠，2組小鼠性別比、周齡、健康狀況及體重均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。Con組小鼠給予自來(lái)水自由飲用，DSS組給予5% DSS(用水溶解)自由飲用，各組小鼠實(shí)驗(yàn)時(shí)間為7 d，第8天處死小鼠。造模后每天觀察小鼠活動(dòng)情況、毛色變化、大便性狀、顏色及有無(wú)出血等情況。

3 美沙拉嗪干預(yù)治療

取小鼠8只，給予5% DSS造模，在造模的同時(shí)給予美沙拉嗪治療，作為美沙拉嗪治療組(MSLZ組)，每天用美沙拉嗪(緩釋顆粒;商品名：艾迪莎)灌胃治療，按實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體表面積比等效劑量換算比率，將每天劑量折算成小鼠等效劑量作為中劑量用量[小鼠用量(g/kg)=人每天口服藥量(g)×0.0026/0.02kg]，時(shí)間為7 d，同樣每天觀察小鼠活動(dòng)情況、毛色變化、大便性狀、顏色及有無(wú)出血等情況。

4 外周血單個(gè)核細(xì)胞分離

第8天取小鼠內(nèi)眥靜脈血，用EDTA-K2抗凝，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMC)，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活性檢測(cè)和計(jì)數(shù)后重懸于含2% 胎牛血清的PBS中，備用。

5 結(jié)腸黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞分離

小鼠結(jié)腸黏膜固有層單個(gè)核細(xì)胞(lamina propria mononuclear cells，LPMC)的分離參閱文獻(xiàn)[5]方法進(jìn)行。取小鼠肛門至盲腸末端結(jié)腸，縱切，去內(nèi)容物，將組織剪碎足夠小，于含EDTA和二硫蘇糖醇(dithi othreitol, DTT)的PBS液中孵育30 min，離心，重復(fù)2次。將組織置于酶液(膠原酶II 含量為0.5 g/L的RPMI-1640)中，37℃水浴消化30 min，離心，過(guò)濾，收集濾液，回收濾渣重復(fù)消化1次，收集所有濾液加入到含有小鼠淋巴細(xì)胞分離液的離心管中離心，采用Ficoll-Hypaque密度梯度離心法分離單個(gè)核細(xì)胞，2% FBS-PBS洗滌，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行活性檢測(cè)和計(jì)數(shù)后重懸于含2%胎牛血清的PBS中，備用。

6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞亞群胞內(nèi)細(xì)胞因子

將分離的單個(gè)核細(xì)胞分成4份，每份細(xì)胞數(shù)為1×106，加PMA/Iono Mixture 體外37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，最后2 h加BFA孵育，洗滌，1份加同型對(duì)照抗體，其余3份分別加入CD3-PE-Cy7/CD4-FITC混合抗體和CD3-PE-Cy7/CD8-PE混合抗體，避光孵育25 min，PBS洗滌，加破膜劑A 液100 μL避光孵育15 min，PBS洗滌，加破膜劑B液100μL，同時(shí)分別加入IL-17-PE/IFN-γ-PerCp-Cy5.5混合抗體、Foxp3-PE-Cy5.5和IFN-γ-PerCp-Cy5.5，避光孵育25 min，洗滌，固定，上流式細(xì)胞儀分析。

7 病理組織分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)

0級(jí)：黏膜固有層無(wú)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；Ⅰ級(jí)：固有層有少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(<10 cells/HPF)，并累及部分隱窩；Ⅱ級(jí)：固有層明顯中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(10～50 cells/HPF)，累及50%以上隱窩；Ⅲ級(jí)：固有層大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)(>50 cells/HPF)，同時(shí)伴有隱窩膿腫；Ⅳ級(jí)：固有層明顯急性炎癥伴有潰瘍形成。

8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 16.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，組間均數(shù)比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 成功建立了小鼠UC模型

DSS誘導(dǎo)的模型組小鼠第4天開(kāi)始體重出現(xiàn)下降，到第7天體重下降超過(guò)15%，MSLZ組小鼠體重自第5天開(kāi)始出現(xiàn)體重下降，體重下降不超過(guò)5%，而對(duì)照組體重?zé)o明顯降低；第4天出現(xiàn)血便，對(duì)照組小鼠大便隱血均為陰性，MSLZ組小鼠有2只第5天大便隱血試驗(yàn)陽(yáng)性；DSS組小鼠7 d內(nèi)無(wú)死亡，MSLZ灌胃治療組無(wú)死亡情況；腸道組織HE染色顯示DSS組結(jié)腸陷窩消失、腺體減少，大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，對(duì)照組結(jié)腸結(jié)構(gòu)無(wú)明顯異常，MSLZ組陷窩、腺體結(jié)構(gòu)清晰，少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，見(jiàn)圖1。

各組小鼠病理組織學(xué)分級(jí)比較：DSS組組織學(xué)分級(jí)大部分小鼠為Ⅲ級(jí)和IV級(jí)；MSLZ組0級(jí)有5例，Ⅰ級(jí)和Ⅱ級(jí)分別為2例和1例，無(wú)Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)；對(duì)照組0級(jí)7例，I級(jí)1例，見(jiàn)表1。

表1 各組小鼠病理組織學(xué)分級(jí)比較

Table 1.Comparision of histological grading among the 3 groups (%.n=8)

Group0ⅠⅡⅢⅣCon87.512.5000MSLZ62.525.012.500DSS0025.050.037.5

Figure 1.UC animal model establishment and mesalazine. treatment. A： mice body weight loss curve.Mean±SD.n=8.*P<0.05vsCon group;△P<0.05vsDDS group. B: HE staining of colon tissue of each group.

圖1 建立小鼠UC模型及美沙拉嗪預(yù)治療模型

2 UC模型小鼠外周血中IL-17、IFN-γ及Foxp3在CD3+T細(xì)胞的表達(dá)升高

在DSS誘導(dǎo)的小鼠UC模型中，其外周血單個(gè)核細(xì)胞中CD3+T細(xì)胞高表達(dá)IL-17、IFN-γ及Foxp3，腸黏膜單個(gè)核細(xì)胞中CD3+T細(xì)胞高表達(dá)IFN-γ和Foxp3，但I(xiàn)L-17的表達(dá)與對(duì)照組無(wú)差異，見(jiàn)圖2。

3 UC模型小鼠腸組織中Th1、Th17和Treg細(xì)胞亞群升高

根據(jù)不同CD4+T細(xì)胞亞群產(chǎn)生細(xì)胞因子的不同，我們進(jìn)一步分析了UC模型小鼠外周血和腸組織中Th1(CD3+CD4+IFN-γ+)、Th17(CD3+CD4+IL-17+)和Treg(CD3+CD4+Foxp3+)細(xì)胞亞群的變化，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)胞內(nèi)細(xì)胞因子檢測(cè)結(jié)果顯示，DSS組小鼠LPMC中Th1、Th17和Treg細(xì)胞亞群較對(duì)照組均顯著升高(均P<0.05)；但DSS組小鼠PBMC中只有Treg細(xì)胞亞群較對(duì)照組升高(P<0.05),見(jiàn)圖3。

Figure 2.Expression of IL-17，IFN-γ and Foxp3 in PBMCs and LPMSs of UC mice. Meam±SD.n=8.*P<0.05，**P<0.01vsCon group.

圖2 UC模型小鼠CD3+T細(xì)胞IL-17、IFN-γ和Foxp3的表達(dá)

Figure 3.Expression of Th1,Th17 and Tregs in PBMCs and LPMCs of UC mice. Mean±SD.n=8.*P<0.05vsCon group.

圖3 UC模型小鼠Th1、Th17和Treg細(xì)胞亞群的變化

4 美沙拉嗪對(duì)UC模型小鼠CD4+T細(xì)胞亞群的影響

為了探討美沙拉嗪治療UC的免疫學(xué)機(jī)制，我們進(jìn)一步檢測(cè)了美沙拉嗪對(duì)UC模型小鼠CD4+T細(xì)胞亞群的影響，見(jiàn)圖4，我們發(fā)現(xiàn)美沙拉嗪預(yù)治療后UC模型小鼠外周血中CD4+Foxp3+T細(xì)胞熒光強(qiáng)度較DSS組降低，提示美沙拉嗪能下調(diào)UC模型小鼠外周血中Treg細(xì)胞中Foxp3的表達(dá)。進(jìn)一步檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，美沙拉嗪能顯著下調(diào)UC模型小鼠腸組織中Th1、Th17和Treg亞群。

討 論

潰瘍性結(jié)腸炎是一種原因不明的直腸和結(jié)腸炎癥，是危害人類健康的慢性疾病之一，據(jù)世界衛(wèi)生組織報(bào)告[6]，該病發(fā)生率為1/10 000～2/10 000，在我國(guó)UC的患病率約為1.16/10 000，實(shí)際的病例數(shù)更多。因此，對(duì)于UC發(fā)病的研究及治療方法的探討也成為醫(yī)療衛(wèi)生界的重要課題。

以往的研究認(rèn)為UC的發(fā)生發(fā)展與IL-4、IL-5、IL-13等介導(dǎo)的Th2型免疫反應(yīng)密切相關(guān)[7]，近期研究認(rèn)為產(chǎn)生IL-17的Th17型細(xì)胞[8]、產(chǎn)生IFN-γ的Th1型細(xì)胞以及Foxp3+Treg細(xì)胞[9]均在UC的發(fā)病中發(fā)揮重要作用。

IL-17是新近發(fā)現(xiàn)的一種促炎癥細(xì)胞因子，其具有強(qiáng)大的促炎反應(yīng)活性，在不同的疾病中發(fā)揮著不同作用。有文獻(xiàn)報(bào)道IL-17通過(guò)IL-17/IL-23軸參與炎癥性腸病的發(fā)生[10]，研究顯示在炎癥性腸病患者中IL-17的產(chǎn)生較正常人明顯增加，這在小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型中也得到了證實(shí)。IFN-γ是Th1細(xì)胞亞群產(chǎn)生的主要細(xì)胞因子，這類細(xì)胞因子在疾病中的研究及其作用機(jī)制都比較明確，在UC發(fā)病中IFN-γ起重要作用，本研究結(jié)果顯示：盡管UC小鼠模型外周血中Th17和Th1細(xì)胞與對(duì)照組無(wú)顯著差異，但在腸組織中產(chǎn)生Th17和Th1細(xì)胞亞群均顯著增高，說(shuō)明Th17和Th1細(xì)胞在UC腸道局部炎癥損傷中起重要作用。

調(diào)節(jié)性T細(xì)胞是一組具有免疫負(fù)調(diào)節(jié)作用的T細(xì)胞亞群，它在維持機(jī)體免疫平衡、形成外周免疫耐受過(guò)程中發(fā)揮重要作用。Treg細(xì)胞可在體外通過(guò)細(xì)胞接觸依賴機(jī)制參與炎癥反應(yīng)，另外Treg細(xì)胞表達(dá)高水平的細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4與抗原提呈細(xì)胞上的B7結(jié)合，誘導(dǎo)色氨酸裂解酶-吲哚胺2,3-二加氧酶活化，介導(dǎo)免疫耐受[11]。同時(shí)Treg細(xì)胞還可通過(guò)調(diào)節(jié)釋放抑制性細(xì)胞因子(IL-10等)參與UC的發(fā)病，其數(shù)量較少或者功能異常均可導(dǎo)致疾病的發(fā)生。王曉紅等[12]在研究大黃、巴豆霜對(duì)三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的UC大鼠模型中發(fā)現(xiàn)在模型組大鼠外周血Treg細(xì)胞的百分比顯著降低；周紅光等[13]在對(duì)三硝基苯磺酸誘導(dǎo)的UC大鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)其模型組外周血及腸系膜淋巴結(jié)中CD4+CD25+Treg細(xì)胞顯著降低；Chao 等[14]在UC患者中發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞比例低于健康人；譚至柔等[15]在UC患者外周血中也發(fā)現(xiàn)了這一現(xiàn)象。另外在T細(xì)胞缺乏的小鼠體內(nèi)輸注CD45RBhighCD4+T細(xì)胞可誘導(dǎo)形成炎癥性腸病模型，同時(shí)可以調(diào)節(jié)Th1型T細(xì)胞產(chǎn)生IFN-γ的效應(yīng)，這證實(shí)了Treg細(xì)胞減少或功能異常均可導(dǎo)致UC的發(fā)病。但是也有部分研究認(rèn)為Treg細(xì)胞在炎癥狀態(tài)下代償性增加，與Th17細(xì)胞亞群呈現(xiàn)協(xié)同狀態(tài)，參與炎癥反應(yīng)。有報(bào)道[11]在活動(dòng)性潰瘍性結(jié)腸炎患者外周血中Treg細(xì)胞明顯高于健康人，且活動(dòng)性潰瘍性結(jié)腸炎比慢性潰瘍性結(jié)腸炎外周血Treg細(xì)胞升高。另外也有研究證實(shí)[8]在小兒UC和克羅恩病中，Treg細(xì)胞數(shù)量較正常人升高，Rismo等[16]在UC成年患者中也證實(shí)了這點(diǎn)。本組實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)在外周血Treg細(xì)胞和病變局部腸道組織中Treg細(xì)胞水平均較正常對(duì)照組升高，這可能與小鼠體內(nèi)環(huán)境不同，炎癥細(xì)胞因子數(shù)量?jī)?yōu)勢(shì)不同相關(guān)，在炎癥狀態(tài)下大量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞也代償性增加，但是其增加水平無(wú)法抗衡促炎因子增加水平，從而發(fā)生炎癥反應(yīng)。同時(shí)這也提示在潰瘍性結(jié)腸炎小鼠中，由于Treg細(xì)胞的異常，可能導(dǎo)致機(jī)體免疫失衡，從而使效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞從循環(huán)系統(tǒng)向腸道局部炎癥部位移行，富集于炎癥損傷部位，從而導(dǎo)致消化道黏膜處于高度活化狀態(tài)，誘發(fā)機(jī)體腸道免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致對(duì)自身抗原不耐受，損傷性細(xì)胞因子釋放增加，導(dǎo)致黏膜損傷。因此，我們認(rèn)為Treg細(xì)胞失衡在潰瘍性結(jié)腸炎發(fā)病中發(fā)揮重要作用。這與郭敏等[17]在大鼠模型中的研究報(bào)道一致。另外國(guó)外有文獻(xiàn)報(bào)道[18]在UC患者外周血、結(jié)腸組織及腸系膜淋巴結(jié)等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其Treg細(xì)胞較正常人升高，其可能的機(jī)制是結(jié)腸組織或腸系膜淋巴結(jié)組織中增加的Treg細(xì)胞在體內(nèi)可能通過(guò)某些共刺激分子或Toll樣受體信號(hào)途徑其抑制效應(yīng)T細(xì)胞的功能被抑制，因此，即使在體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其外周血和病變組織中Treg細(xì)胞升高，這種升高仍不能逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)生及發(fā)展，其具體機(jī)制目前暫未明確[19]。因此，我們認(rèn)為在UC小鼠外周血和病變結(jié)腸組織中升高的Treg可能在不同程度上限制疾病的發(fā)展，但是不能逆轉(zhuǎn)疾病的發(fā)生。

Figure 4.Efflect of MSLZ on CD4+T cell subsets in UC mice. Mean±SD.n=8.*P<0.05,vsCon group;△P<0.05 vs, MSLZ group.

圖4 美沙拉嗪對(duì)UC模型小鼠CD4+T細(xì)胞亞群的影響

美沙拉嗪是一種新型5-氨基水楊酸控釋劑，是治療潰瘍性結(jié)腸炎的首選藥物之一，特別適用于對(duì)柳氮磺吡啶不能耐受的患者的急性發(fā)作。本組實(shí)驗(yàn)采用美沙拉嗪微膠顆粒予小鼠灌胃，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[20]采用中劑量用量預(yù)治療小鼠潰瘍性結(jié)腸炎能有效減輕小鼠腸道炎癥，因此本組實(shí)驗(yàn)選用中劑量灌胃治療。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，采用美沙拉嗪治療小鼠7d后結(jié)腸組織炎癥滲出較少，隱窩及腺體結(jié)構(gòu)清晰，炎癥程度較DSS誘導(dǎo)的UC小鼠組輕，其臨床療效顯著。因此，我們認(rèn)為美沙拉嗪灌胃預(yù)治療能有效降低腸道炎癥。而其作用的機(jī)制暫未完全明確，有研究認(rèn)為其主要是通過(guò)作用于腸道炎癥黏膜，抑制引起炎癥的前列腺素的合成和炎癥介質(zhì)白三烯的形成，清除氧自由基，抑制腸黏膜的脂肪酸氧化，降低腸上皮通透性，從而對(duì)腸道壁炎癥起顯著的消炎作用，對(duì)發(fā)炎的腸壁結(jié)締組織效果尤佳[21]。其免疫學(xué)機(jī)制研究較少，有報(bào)道[22]認(rèn)為其可能通過(guò)抑制結(jié)腸組織下調(diào)NF-κB的表達(dá)，減少結(jié)腸局部炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，最終達(dá)到治療潰瘍性結(jié)腸炎的目的；也可能通過(guò)影響其它細(xì)胞因子或信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑發(fā)揮抗炎作用[23- 24]，然而美沙拉嗪對(duì)T細(xì)胞亞群的研究較少，且機(jī)制暫未明確。本組實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)美沙拉嗪預(yù)治療后UC小鼠炎癥減輕，且預(yù)治療組小鼠外周血分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞活性降低，這提示美沙拉嗪可能調(diào)節(jié)Th1細(xì)胞活性。有研究顯示[25]美沙拉嗪釋放一氧化氮衍生物NCX-456，而這種NCX-456可抑制Th1細(xì)胞誘導(dǎo)的細(xì)胞因子的釋放，同時(shí)促進(jìn)抑炎因子的產(chǎn)生，在UC中發(fā)揮重要的抗炎作用，且NCX-456能抑制細(xì)胞增殖，導(dǎo)致活化的腸黏膜固有層Th1細(xì)胞選擇性凋亡，從而達(dá)到抗炎作用，但是其具體誘導(dǎo)Th1細(xì)胞的調(diào)節(jié)機(jī)制及途徑還有待進(jìn)一步明確。另外本實(shí)驗(yàn)研究顯示美沙拉嗪預(yù)治療后下調(diào)了外周血產(chǎn)生IL-17的Th17細(xì)胞活性，但是對(duì)組織中Th17的活性無(wú)影響。Th17細(xì)胞活化可誘導(dǎo)NF-κB信號(hào)途徑活化，從而產(chǎn)生誘導(dǎo)型一氧化氮合酶、環(huán)氧化酶2等，同時(shí)產(chǎn)生大量IL-17介導(dǎo)促炎反應(yīng)，美沙拉嗪預(yù)治療UC下調(diào)Th17細(xì)胞的活性，從而阻斷或減弱NF-κB信號(hào)途徑，降低促炎因子的分泌，從而達(dá)到減輕炎癥反應(yīng)的目的[26]。本組實(shí)驗(yàn)美沙拉嗪可降低外周血Th17水平，而局部炎癥部位Th17細(xì)胞呈下降趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這可能與局部炎癥嚴(yán)重，短時(shí)間內(nèi)美沙拉嗪不能快速影響Th17細(xì)胞的功能有關(guān)，這也提示在急性炎癥嚴(yán)重時(shí)治療周期及治療劑量可能需要根據(jù)病情適當(dāng)調(diào)整。同時(shí)，本組實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)美沙拉嗪預(yù)治療能降低外周血及病變組織中Treg細(xì)胞活性，但是其水平仍然較對(duì)照組升高，這提示美沙拉嗪可能誘導(dǎo)Treg細(xì)胞參與其對(duì)疾病的治療。在炎癥早期誘導(dǎo)Treg細(xì)胞產(chǎn)生，但是炎癥緩解后Treg細(xì)胞活性迅速下降，這與Requena 等[26]的報(bào)道一致。但是其具體調(diào)節(jié)機(jī)制還有待進(jìn)一步明確。

綜上所述，我們?cè)贒SS誘導(dǎo)小鼠UC模型中發(fā)現(xiàn)效應(yīng)性CD4+T細(xì)胞亞群Th17、Th1和調(diào)節(jié)性CD4+T細(xì)胞亞群都升高，尤其是Treg的代償性升高可能在UC發(fā)病中起重要作用，美沙拉嗪可能通過(guò)調(diào)節(jié)Th1、Th17和Treg細(xì)胞亞群的功能從而發(fā)揮抗炎作用。

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Effect of mesalazine on Th1, Th17 and Treg cells in mice with DSS-induced ulcerative colitis

ZHU Bin1, ZHANG Han-xian2, 3, ZENG Jin-cheng2, 4, AN Bo-ran3, XU Jun-fa2, 4, SHU Jian-chang1

(1FirstClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity,Guangzhou510632,China;2InstituteofLaboratoryMedicine,GuangdongMedicalCollege,Dongguan524808,China;3GuangdongMedicalCollege,Zhanjiang524023,China;4GuangdongProvincialKeyLaboratoryofMedicalMolecularDiagnostics,Dongguan524808,China.E-mail:shujc62@hotmail.com)

AIM: To investigate the effect of mesalazine treatment on regulation of Th1, Th17 and Treg cells in mice with dextran sulfate sodium (DSS)-induced ulcerative colitis (UC). METHODS: The expression of IL-17, IFN-gamma and Foxp3 in the peripheral blood mononuclear cells (PBMC) and intestinal mucosa lamina propria mononuclear cells (LPMC) of DSS-induced UC mice was detected by flow cytometry analysis. The effect of mesalazine treatment on regulaiton of Th1, Th17 and Treg cells in the mice with DSS-induced ulcerative colitis was examined.RESULTS: The expression of IL-17, IFN-γ and Foxp3 on CD4+T cells were significantly higher in the PBMC of DSS-induced mice than those in control group. CD4+IFN-γ+T cells and CD4+Foxp3+T cells were higher in LPMC than those in control group, except CD4+IL-17+T cells. Moreover, the Th1, Th17 and Treg cells were higher in DSS group than those in control group in LPMC. However, only Tregs was higher in PBMC. Pre-treatment with mesalazine significantly decreased the number of Th17, Th1 and Treg cells of UC model mice both in PBMC and LPMC.CONCLUSION: The Th1, Th17 and Tregs cells in DSS-induced mice were significantly higher than those in control mice, suggesting that CD4+T cell subsets play an important role in the pathogenesis of UC. Mesalazine may play a role in the treatment of UC by regulating the Th1, Th17 and Tregs cells.

Dextran sulfate sodium; Colitis, ulcerative; Mesalazine

1000- 4718(2014)12- 2219- 07

2014- 01- 27

2014- 09- 12

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.81273237; No.30972779)；廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(No. 2011B061300098)

R574.62

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.018

△通訊作者 Tel: 020-34403830; E-mail: shujc62@hotmail.com