轉(zhuǎn)錄因子Bach1對人微血管內(nèi)皮細胞的作用研究*

劉俊許， 蔣 麗， 魏香香， 牛 琮， 陳思鋒， 孟 丹

(復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理與病理生理學系，上海 200032)

轉(zhuǎn)錄因子Bach1對人微血管內(nèi)皮細胞的作用研究*

劉俊許， 蔣 麗， 魏香香， 牛 琮， 陳思鋒， 孟 丹△

(復旦大學基礎(chǔ)醫(yī)學院生理與病理生理學系，上海 200032)

目的： 研究轉(zhuǎn)錄因子Bach1對人微血管內(nèi)皮細胞功能的影響。方法: 利用小干擾RNA(small interfering RNA，siRNA)細胞轉(zhuǎn)染技術(shù)下調(diào)內(nèi)皮細胞Bach1表達；用Matrigel管腔形成實驗檢測內(nèi)皮細胞體外血管新生的能力；用Transwell小室法檢測細胞遷移；用CCK-8法測定細胞增殖；用實時熒光定量PCR、Western blotting和ELISA法檢測細胞中血紅素氧合酶1(heme oxygenase 1，HO-1)和血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)mRNA 和蛋白的表達情況；用轉(zhuǎn)染報告基因的方法檢測VEGF基因的轉(zhuǎn)錄活性。結(jié)果: 下調(diào)內(nèi)皮細胞Bach1表達明顯促進人微血管內(nèi)皮細胞遷移和管腔形成能力，對內(nèi)皮細胞增殖能力無明顯影響；抑制Bach1表達促進內(nèi)皮細胞HO-1 mRNA 和蛋白的表達，增加VEGF 轉(zhuǎn)錄活性及mRNA和蛋白的表達。結(jié)論: 抑制轉(zhuǎn)錄因子Bach1表達可增加內(nèi)皮細胞HO-1和VEGF的表達，促進人微血管內(nèi)皮細胞遷移和管腔形成，提示Bach1是負性調(diào)控血管新生的因子。

轉(zhuǎn)錄因子Bach1； 人微血管內(nèi)皮細胞； 血管內(nèi)皮細胞生長因子； 血紅素氧合酶1； 細胞遷移

成人體內(nèi)的血管新生(angiogenesis)是指從原有的血管通過發(fā)芽的方式長出原始的血管網(wǎng)絡(luò)，包括血管周圍基質(zhì)的降解、內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和管狀結(jié)構(gòu)的形成；隨后這一初級的毛細血管網(wǎng)被平滑肌細胞和周細胞等血管支持細胞包裹，逐步形成具有完整結(jié)構(gòu)的成熟的血管。這些過程受到血管生成促進因子和抑制因子的調(diào)控。血管生成促進因子包括血管內(nèi)皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)等[1]。

血管新生是由多種因子參與調(diào)控的復雜的病理生理過程，其中轉(zhuǎn)錄因子起著關(guān)鍵的調(diào)控作用。轉(zhuǎn)錄因子Bach1是一個轉(zhuǎn)錄抑制因子，屬于堿性亮氨酸拉鏈蛋白家族成員。人的Bach1蛋白含736個氨基酸，分子量為92 kD[2]。在細胞沒有受到外界刺激的狀態(tài)下，轉(zhuǎn)錄因子Bach1在細胞核內(nèi)與小Maf蛋白結(jié)合形成異二聚體，反式作用于抗氧化反應(yīng)元件(anti-oxidative response element，ARE)，抑制ARE介導的靶基因表達。紅系衍生核因子相關(guān)因子-2(NF-E2-related factor 2，Nrf2)與Bach1之間存在相互競爭的關(guān)系。當細胞受到氧化應(yīng)激刺激時，Bach1與ARE分離，而Nrf2與ARE結(jié)合, 增強抗氧化酶的表達[3]。Bach1調(diào)控的基因有血紅素氧合酶-1(heme oxygenase-1, HO-1)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-glutamyl cysteine synthetase，γ-GCS)和谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione S-transferase，GST)等[4]。我們以往的研究發(fā)現(xiàn)，Bach1在人微血管內(nèi)皮細胞中有較高表達[5]，但是Bach1對血管新生的影響還不清楚。本文中我們研究了Bach1在人微血管內(nèi)皮細胞遷移、增殖以及管腔形成能力中的作用及分子機制。

材 料 和 方 法

1 材料

EBM-2培養(yǎng)基購于Lonza；胎牛血清和Lipofectamine 2000購于Invitrogen；抗Bach1抗體、抗HO-1抗體和Bach1 siRNA 購于Santa Cruz；抗β-actin抗體購于Sigma；人VEGF酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購自欣博盛生物科技有限公司；SYBR Green 購于Bio-Rad；Matrigel購于BD；CCK-8試劑盒購自日本同仁化學研究所。

2 方法

2.1 人微血管內(nèi)皮細胞培養(yǎng) 人微血管內(nèi)皮細胞株(human microvascular endothelial cells，HMVECs)為美國馬薩諸塞大學邵榮教授贈送[6]，用含2%胎牛血清的EBM-2培養(yǎng)基，在37 ℃、 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2.2 細胞轉(zhuǎn)染 取對數(shù)生長期HMVECs，消化后種于6孔板。細胞分為未轉(zhuǎn)染組(control)、轉(zhuǎn)染對照siRNA組(Con si)和轉(zhuǎn)染Bach1 siRNA(Bach1 si)組。未轉(zhuǎn)染組加含血清的EBM-2培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染組加終濃度為80 nmol/L的Bach1特異性小干擾RNA(上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司)，對照組加終濃度為80 nmol/L的陰性對照siRNA。用Lipofectamine 2000 轉(zhuǎn)染細胞，步驟按試劑說明書進行。培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗。

2.3 實時熒光定量PCR 收集細胞，采用Trizol法提取細胞總RNA。按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas)說明書采用隨機引物進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。采用實時定量PCR試劑盒(Bio-Rad)，以SYBR Green為熒光探針，在real-time analyzer(Bio-Rad)儀器上進行實時定量PCR反應(yīng)并分析結(jié)果，以GAPDH作為內(nèi)參照。Bach1 的上游引物為5’-CACAATTCTTCCATAGACCCTC-3’，下游引物為5’-TCTGCCACTTCTCGCTCC-3’；HO-1的上游引物為5’-TTTGAGGAGTTGCAGGAGC-3’，下游引物為5’-AGGACCCATCGGAGAAGC-3’；VEGF165的上游引物為5’-ATCTTCAAGCCATCCTGTGTGC-3’，下游引物為5’-CAAGGCCCACAGGGATTTTC-3’；GAPDH的上游引物為5’-CCATCTTCCAGGAGCGAGATC-3’，下游引物為5’-GCCTTCTCCATGGTGGTGAA-3’。實時定量PCR結(jié)果以2-ΔCt表示相對表達量，Ct為循環(huán)數(shù)，ΔCt為目的基因Ct值與內(nèi)參照基因Ct值的差。每次實驗重復3次。

2.4 蛋白免疫印跡 用RIPA裂解液裂解細胞30 min，4 ℃下 12 000×g離心10 min后取上清。用蛋白測定試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白上樣量60 μg，加上樣緩沖液，沸水中煮5 min。12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠以100 V恒壓電泳，經(jīng)250 mA恒流濕轉(zhuǎn)膜3h，將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜(Millipore)。5%脫脂牛奶封閉1 h后分別加Bach1 (1∶500)、HO-1(1∶500)或β-actin(1∶4 000)抗體, 4 °C孵育過夜；TBST洗3次，加上辣根過氧化物酶HRP標記的Ⅱ抗(1∶3 000)，室溫孵育1 h 30 min，TBST洗4次后進行ECL顯色發(fā)光。X光膠片用ImageJ圖像分析軟件進行蛋白定量分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin比值作相對量分析。每次實驗重復3次。

2.5 內(nèi)皮細胞管腔形成實驗 參照我們實驗室已有的方法[7]，將轉(zhuǎn)染Bach1 siRNA、對照siRNA 48 h或未轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細胞接種在鋪有50 μL Matrigel的96孔板中(每組3復孔)，細胞密度5×107cells/L，體積200 μL。放置37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育，10 h后顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍照，用ImageJ軟件計算管腔長度，每次試驗重復3次。

2.6 細胞遷移實驗 將轉(zhuǎn)染Bach1 siRNA、對照siRNA 48 h或未轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細胞接種在Transwell上室中，細胞密度4×108cells/L，體積200 μL。在Transwell下室中加入2% FBS的培養(yǎng)基800 μL。放置37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育，10 h后取出小室，用棉簽擦去上層細胞，置于4% 預冷的多聚甲醛中固定10 min，0.1% 結(jié)晶紫染色30 min，PBS洗3遍，倒置顯微鏡下隨機選取5個視野進行拍照并計數(shù)染色細胞，每次實驗重復3次。

2.7 細胞增殖實驗 將轉(zhuǎn)染Bach1 siRNA、對照siRNA 48 h或未轉(zhuǎn)染的內(nèi)皮細胞接種在96孔板中，細胞密度3×108cells/L，體積200 μL。放置37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育，不同時點后加入含CCK-8的培養(yǎng)液，CCK-8與培養(yǎng)液的體積比例為1∶ 10，放置37 ℃細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h，在酶標儀上測定450 nm吸光度。每次實驗重復3次。

2.8 報告基因螢光素酶檢測 按照Invitrogen公司說明書，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染細胞，將含有VEGF啟動子片段(2.4 kb)的報告基因和β-半乳糖質(zhì)粒，以及Bach1 siRNA或?qū)φ誷iRNA共轉(zhuǎn)染到內(nèi)皮細胞，以轉(zhuǎn)染對照質(zhì)粒pGL2為空白對照。轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞，制備細胞裂解物。按照螢光素酶報告基因分析系統(tǒng)的說明書，在螢光素酶報告分析儀上檢測裂解物的熒光值。β-半乳糖酶活性的檢測是將裂解物與β-半乳糖酶檢測底物在37 °C孵育1 h，然后置于酶標儀上，在420 nm波長下測吸光度值。螢光素酶報告基因的熒光值與內(nèi)參照β-半乳糖酶活性的比值即代表所檢測的VEGF啟動子片段的轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性。每次實驗重復3次。

2.9 酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測培養(yǎng)上清中VEGF水平 內(nèi)皮細胞轉(zhuǎn)染Bach1 siRNA 或?qū)φ誷iRNA，48 h后收集培養(yǎng)上清，上清中VEGF的含量用人VEGF ELISA試劑盒檢測，按照說明書步驟進行。通過VEGF的標準曲線計算上清中VEGF的含量，并用細胞蛋白含量作校正，以ng/g protein表示。每次實驗重復3次。

3 統(tǒng)計學處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差(mean±SD)表示。采用Prism 5.0統(tǒng)計軟件進行分析，組間均數(shù)比較用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 Bach1表達下調(diào)促進內(nèi)皮細胞官腔形成

Bach1 si組的Bach1 mRNA表達較Con si組降低66%(P<0.05)，Bach1蛋白表達較Con si組降低50%(P<0.05)，而Con si組與control組相比無明顯差別，見圖1。為了明確Bach1在體外血管新生中的作用，我們將Bach1表達下調(diào)的內(nèi)皮細胞種在Matrigel上，觀察Bach1對內(nèi)皮細胞管腔形成能力的影響，發(fā)現(xiàn)抑制Bach1表達明顯促進內(nèi)皮細胞管腔狀結(jié)構(gòu)的形成(P<0.05)，Con si組與control組管腔狀結(jié)構(gòu)的形成無明顯差別，見圖2。

2 Bach1表達下調(diào)促進內(nèi)皮細胞的遷移，對細胞增殖無影響

Bach1 siRNA或?qū)φ誷iRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞48 h后，將內(nèi)皮細胞接種在Transwell上，培養(yǎng)10 h后對遷移到膜下面的細胞進行計數(shù)。結(jié)果顯示，Bach1表達下調(diào)明顯促進內(nèi)皮細胞的遷移能力(P<0.05)，而Con si組與control組細胞遷移能力無明顯差別，見圖3。此外，我們用CCK-8的方法檢測Bach1抑制對內(nèi)皮細胞增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Bach1表達下調(diào)對內(nèi)皮細胞的增殖無明顯影響，見圖4。

Figure 1.Bach1 siRNA inhibited Bach1 mRNA and protein expression in HMVECs. HMVECs were transfected with control siRNA(Con si) orBach1 siRNA (Bach1 si), and the untransfected cells were as the control. At 48 h, the cells were harvested for detecting the Bach1 mRNA level by real-time PCR (A) and Bach1 protein level by Western blotting (B). Mean±SD.n=3.**P<0.01vsCon si group.

圖1Bach1 siRNA抑制人微血管內(nèi)皮細胞Bach1 mRNA和蛋白的表達

Figure 2.Knockdown ofBach1 expression promoted the tube formation in HMVECs. HMVECs transfected with control siRNA (Con si) orBach1 siRNA (Bach1 si) were seeded onto Matrigel and incubated for 10 h. The untransfected cells were as the negative control. relative tube lengths were normalized by the control. Scale bar=50 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon si group.

圖2 Bach1表達下調(diào)促進內(nèi)皮細胞管腔形成

Figure 3.Knockdown ofBach1 expression enhanced endothelial cell migration. HMVECs were transfected with control siRNA (Con si) orBach1 siRNA (Bach1 si) for 48 h. Cell migration was measured by Transwell chamber. The data are expressed as the fold change relative to the control. Scale bar=100 μm. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon si group.

圖3 Bach1表達下調(diào)促進內(nèi)皮細胞的遷移

3 Bach1表達下調(diào)增加內(nèi)皮細胞HO-1 mRNA和蛋白的表達

抑制Bach1表達明顯上調(diào)HO-1 mRNA的表達(P<0.05)，增加HO-1蛋白的表達(P<0.05)，見圖5。

4 Bach1表達下調(diào)增加內(nèi)皮細胞VEGF轉(zhuǎn)錄活性、mRNA和蛋白的表達

我們用Bach1 siRNA轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細胞，觀察Bach1表達下調(diào)對VEGF轉(zhuǎn)錄活性、mRNA和蛋白表達的影響。我們發(fā)現(xiàn)，抑制Bach1表達明顯促進VEGF的轉(zhuǎn)錄激活(P<0.05)，并增加內(nèi)皮細胞VEGF mRNA表達及上清中VEGF蛋白的表達(P<0.05)，見圖6。

Figure 4.Knockdown ofBach1 expression had little effect on endothelial cell proliferation. HMVECs were transfected with control siRNA(Con si) orBach1 siRNA(Bach1 si) for 48 h. The untransfected cells were as the control. Cell proliferation was measured using CCK-8 assay. Mean±SD.n=3.

圖4 Bach1表達下調(diào)對內(nèi)皮細胞的增殖無影響

Figure 5.Bach1 silencing increased the mRNA and protein expression of HO-1. HMVECs were transfected with control siRNA(Con si) orBach1 siRNA(Bach1 si) for 48 h. The untransfected cells were as the negative control. A： HO-1 mRNA level was analyzed by real-time PCR；B： HO-1, Bach1, and β-actin protein levels were determined by Western blotting. Mean±SD.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsCon si group.

圖5 Bach1表達下調(diào)促進內(nèi)皮細胞HO-1 mRNA和蛋白的表達

Figure 6.Bach1 silencing increased VEGF transcriptional activation, mRNA and protein expression in HMVECs. A: the relative luciferase activity was determined by the ratio of luciferase to β-galactosidase activity and normalized to the control； B: VEGF mRNA levels were determined by real-time PCR; C: the VEGF content in the supernatants was determined by ELISA. Mean±SD.n=3.*P<0.05vsCon si group.

圖6 Bach1表達下調(diào)增加內(nèi)皮細胞VEGF轉(zhuǎn)錄活性、mRNA和蛋白的表達

討 論

近年來，促血管新生已成為治療冠心病的一個新策略，是當前國際上的研究熱點。因此，尋找促血管新生的關(guān)鍵分子靶點，已成為當前治療性血管新生研究領(lǐng)域的中心焦點。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制轉(zhuǎn)錄因子Bach1的表達可增加內(nèi)皮細胞HO-1和VEGF的表達，促進人微血管內(nèi)皮細胞遷移和管腔形成。這些結(jié)果提示Bach1是負性調(diào)控血管新生的因子。

Bach1是一個血紅素結(jié)合蛋白，它結(jié)構(gòu)高度保守，廣泛存在于哺乳動物各種組織中。Bach1主要包含2個功能結(jié)構(gòu)域：N端的BTB/POZ結(jié)構(gòu)域，主要參與形成蛋白二聚體，與轉(zhuǎn)錄抑制有關(guān)；C端的亮氨酸拉鏈bZIP結(jié)構(gòu)域，可與細胞核內(nèi)小Maf蛋白形成異二聚體，在細胞核內(nèi)與目的基因結(jié)合[3]。我們以往研究發(fā)現(xiàn)Bach1半胱氨酸殘基557和574位點在Bach1的功能調(diào)節(jié)中起關(guān)鍵作用，砷可以通過氧化這些位點Bach1與ARE的解離，解除Bach1的轉(zhuǎn)錄抑制作用，促進HO-1的表達[5]。但是Bach1在血管新生中的作用以及調(diào)控機制還不十分清楚。本文研究證實抑制Bach1表達明顯促進人微血管內(nèi)皮細胞遷移以及管腔狀結(jié)構(gòu)的形成，提示Bach1是調(diào)控血管新生的負調(diào)控因子。Dohi等[8]發(fā)現(xiàn)，Bach1可以抑制氧化應(yīng)激引起的p53依賴的細胞衰老。最近研究發(fā)現(xiàn)[9]，Bach1參與調(diào)控氧化應(yīng)激反應(yīng)以及細胞周期，提示Bach1在細胞功能調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Yano等[10]報道，Bach1基因缺乏可保護小鼠心肌缺血再灌注損傷，抑制Bach1使心肌細胞凋亡減少。Kondo等[11]研究發(fā)現(xiàn)，Bach1基因缺乏小鼠對氧化應(yīng)激引起的胰島β細胞損傷有保護作用。Hou等[12]也發(fā)現(xiàn)，HO-1的上調(diào)和Bach1的下調(diào)保護氧化應(yīng)激引起的肝細胞損傷。這些研究表明Bach1基因缺乏對細胞損傷有保護作用，這與我們的研究結(jié)果是一致的，我們也證實Bach1基因下調(diào)促進內(nèi)皮細胞的遷移，對內(nèi)皮細胞管腔樣結(jié)構(gòu)的形成有促進作用。

本研究證實，下調(diào)內(nèi)皮細胞Bach1表達促進內(nèi)皮細胞HO-1 mRNA和蛋白的表達，增加VEGF 轉(zhuǎn)錄活性、mRNA和蛋白的表達。VEGF是目前被認為的最重要的促進血管生成的因子，其促進血管細胞的增殖和遷移，促進具有降解基膜作用的蛋白酶的釋放，以及促進內(nèi)皮細胞形成管腔[13-14]。大量動物實驗和臨床研究顯示VEGF等促血管生長因子蛋白和基因應(yīng)用于冠心病患者可增加缺血心肌灌注、減小梗死面積、改善心功能[15]。以往研究表明，HO-1是重要的VEGF轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，HO-1表達增高促進VEGF高表達。此外，HO-1還可以催化血紅素降解生成膽紅素, 一氧化碳和Fe2+，這些產(chǎn)物具有抗氧化損傷、抗炎、抗凋亡和抗增殖等作用，HO-1在許多疾病中起著重要的保護作用[16-18]。因此我們推測Bach1很可能通過影響HO-1蛋白的表達，調(diào)節(jié)VEGF的轉(zhuǎn)錄活性以及mRNA和蛋白表達，進而影響血管新生。此外，我們發(fā)現(xiàn)，Bach1基因下調(diào)對內(nèi)皮細胞的增殖影響不大，其中的機制不十分清楚，還有待進一步研究。

總之，本研究證實，抑制轉(zhuǎn)錄因子Bach1表達增加內(nèi)皮細胞HO-1和VEGF的表達，促進人微血管內(nèi)皮細胞遷移和管腔形成。這項研究為闡明Bach1調(diào)控血管新生的作用和分子機制提供了理論依據(jù)，并為臨床尋找有效的血管新生干預靶點提供了新的思路。

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Roles of transcription factor Bach1 in human microvascular endothelial cell function

LIU Jun-xu, JIANG Li, WEI Xiang-xiang, NIU Cong, CHEN Si-feng, MENG Dan

(DepartmentofPhysiologyandPathophysiology,SchoolofBasicMedicalSciences，F(xiàn)udanUniversity,Shanghai200032,China.E-mail:dmeng@fudan.edu.cn)

AIM: To determine the role of transcription factor Bach1 in the functions of human microvascular endothelial cells (HMVECs). METHODS:Bach1 siRNA was transfected into HMVECs to knock down the expression ofBach1.Invitroendothelial cell tube formation assay in Matrigel culture was used as a surrogate assay for angiogenic potential. Migration of HMVECs was determined by using Transwell chambers. Cell proliferation was measured by CCK-8 assay. Real-time PCR, Western blotting, and ELISA were employed to determine mRNA expression and protein level. Reporter assay was performed to determine vascular endothelial growth factor (VEGF) transcriptional activity. RESULTS: Knockdown ofBach1 expression in HMVECs led to an increase in the tube formation and increased endothelial cell migration ability, whereas it has little effect on cell proliferation.Bach1 silencing increased the mRNA and protein expression of heme oxygenase-1 (HO-1), and enhanced VEGF transcriptional activation, and mRNA and protein expression.CONCLUSION:Bach1 silencing increases HO-1 and VEGF expression, thus promoting the cell migration and tube formation of HMVECs, indicating that Bach1 is a repressor for angiogenesis.

Transcription factor Bach1; Human microvascular endothelial cells; Vascular endothelial growth factor; Heme oxygenase-1; Cell migration

1000- 4718(2014)12- 2195- 06

2014- 08- 26

2014- 09- 13

國家自然科學基金資助項目(No.81170298; No.81270410); 國家基礎(chǔ)科學人才培養(yǎng)基金資助項目(No.J1210041); 上海市衛(wèi)生局科研項目(No.c106629)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.014

△通訊作者 Tel： 021-54237392； E-mail: dmeng@fudan.edu.cn