中介素抑制高肺血流性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織膠原生成*

龐璐璐， 齊建光， 高 揚(yáng)， 金紅芳， 杜軍保

(北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科，北京 100034)

中介素抑制高肺血流性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織膠原生成*

龐璐璐， 齊建光△， 高 揚(yáng)， 金紅芳， 杜軍保

(北京大學(xué)第一醫(yī)院兒科，北京 100034)

目的： 研究中介素(IMD)對高肺血流性肺動(dòng)脈高壓大鼠肺組織膠原生成和沉積的調(diào)節(jié)作用及其機(jī)制。方法: 健康雄性SD大鼠20只，隨機(jī)分為對照組(n=7)、分流組(n=7)和分流+IMD組(n=6)。對后2組大鼠行腹主動(dòng)脈-下腔靜脈分流術(shù)。8周后，對分流+IMD組大鼠，皮下埋微量滲透泵持續(xù)給予IMD 1.5 μg·kg-1·h-1。繼續(xù)飼養(yǎng)2周后，比較各組大鼠肺動(dòng)脈平均壓(mPAP)、肺中、小動(dòng)脈相對中膜厚度(RMT)，肺組織羥脯氨酸、Ⅰ和Ⅲ 型膠原、骨形成蛋白-2(BMP-2)含量和I、III型前膠原mRNA表達(dá)水平。結(jié)果: 與對照組相比，分流組大鼠mPAP明顯上升，肺中、小動(dòng)脈RMT明顯增加，肺組織羥脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯增多，Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)上調(diào)，BMP-2含量明顯增多。IMD則使分流大鼠肺動(dòng)脈壓力明顯回降，肺血管結(jié)構(gòu)改變緩解，膠原沉積減少，BMP-2含量降低，Ⅰ、Ⅲ 型前膠原mRNA表達(dá)下調(diào)。結(jié)論: IMD可通過抑制高肺血流大鼠肺組織膠原生成和沉積，緩解高肺血流性肺動(dòng)脈高壓和肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)形成，該作用可能與BMP-2途徑有關(guān)。

肺動(dòng)脈高壓; 高肺血流; 膠原; 中介素

中介素(intermedin, IMD)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種心血管保護(hù)性多肽，參與了多種心血管疾病的發(fā)生發(fā)展過程。既往研究顯示，IMD可呈劑量依賴性地舒張肺血管，降低肺動(dòng)脈壓力[1]。我們新近的研究表明，外源性應(yīng)用IMD可緩解高肺血流大鼠肺動(dòng)脈高壓和肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)的形成[2]。膠原構(gòu)成細(xì)胞外基質(zhì)的框架，以膠原沉積為主要特征的肺血管基質(zhì)重塑是高肺血流性肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)的重要組成部分[3]。IMD是否可通過干預(yù)肺組織膠原合成和沉積從而調(diào)節(jié)高肺血流性血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)和肺動(dòng)脈高壓的形成，目前尚不清楚。本研究通過觀察長期應(yīng)用IMD對高肺血流大鼠肺組織膠原合成和沉積的影響及機(jī)制，探討IMD對高肺血流性肺動(dòng)脈高壓和肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)的作用機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 動(dòng)物

清潔級雄性SD大鼠20只，體重160g±10 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院(SCXK-2007-004)。

2 主要儀器和試劑

微量滲透泵2002型購自ALZE；中介素購自Phoenix；引物和探針由上海生工生物工程有限公司合成；大鼠Ⅰ、Ⅲ型膠原酶聯(lián)免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay, ELISA)試劑盒購自武漢伊艾博科技有限公司；羥脯氨酸試劑盒和大鼠骨形成蛋白2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2) ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

3 主要方法

3.1 動(dòng)物模型的制備及給藥 將20只SD大鼠隨機(jī)分為3組：對照(control)組(n=7)，分流(shunt)組(n=7)和分流+IMD(shunt+IMD)組(n=6)。分流組和分流+IMD 組大鼠行腹主動(dòng)脈-下腔靜脈分流術(shù)[4]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3～4 mL/kg麻醉后，取仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上。腹部正中切口，沿腹主動(dòng)脈左側(cè)壁分開后腹膜，顯露腹主動(dòng)脈及下腔靜脈，用哈巴狗鉗于左腎動(dòng)脈起始部下方將腹主動(dòng)脈夾閉。以腹主動(dòng)脈的左腎動(dòng)脈起始部至其末端段的下2/3處之左側(cè)壁為穿刺點(diǎn)，用12號一次性針頭以45°角穿透腹主動(dòng)脈壁進(jìn)入相鄰的下腔靜脈內(nèi)，撤出針頭，再用9-0號線縫合腹主動(dòng)脈壁的穿刺口。之后移開哈巴狗鉗，若觀察到下腔靜脈顏色由暗變紅，血流有波動(dòng)，證實(shí)分流手術(shù)成功。用4號絲線分別連續(xù)縫合腹膜、肌層和皮膚。對照組僅開腹暴露腹主動(dòng)脈及下腔靜脈，不做分流術(shù)。大鼠飼養(yǎng)8周后，對分流+IMD組大鼠，于背部皮下做一長約1 cm切口，埋置微量滲透泵，持續(xù)皮下給藥2周，劑量為1.5 μg·kg-1·h-1。各組大鼠飼養(yǎng)條件相同。

3.2 肺動(dòng)脈壓力的測定 于實(shí)驗(yàn)10周后(第70天)以右心導(dǎo)管法測定肺動(dòng)脈壓力[5]。大鼠腹腔注射10%水合氯醛3～4 mL/kg麻醉。分離大鼠右側(cè)頸外靜脈，將聚乙烯導(dǎo)管一端插入右側(cè)頸外靜脈，經(jīng)上腔靜脈、右心房、右心室進(jìn)入肺動(dòng)脈，另一端經(jīng)壓力傳感器與多導(dǎo)生理記錄儀(成都泰盟科技有限公司)相連，描記肺動(dòng)脈壓力曲線，記錄肺動(dòng)脈平均壓(mean pulmonary artery pressure, mPAP)。

3.3 肺中、小動(dòng)脈相對中膜厚度的觀測 大鼠開胸取相同部位肺葉固定于4%多聚甲醛中，乙醇脫水，二甲苯透明后石蠟包埋，切片。以醛復(fù)紅染色彈力纖維。光鏡下觀察切片的肺肌型動(dòng)脈(在光鏡下具有完整的內(nèi)外兩層彈力層)。應(yīng)用CMIAS 圖像處理與分析系統(tǒng)(Leica)計(jì)算肺中、小肌型動(dòng)脈的相對中膜厚度(relative medial thickness, RMT)，每只大鼠測量6～10個(gè)肺中型(外徑50～150 μm)和小型(15～50 μm)肌型動(dòng)脈的RMT，然后求其均值作為該大鼠的RMT值[6]。

3.4 肺組織羥脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量的測定 稱取肺組織，加入10倍體積的緩沖液，勻漿后采用南京建成羥脯氨酸含量的測定試劑盒測定肺組織羥脯氨酸含量，操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

ELISA法測定肺組織Ⅰ、Ⅲ型膠原含量，操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

3.5 肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)水平的測定 Trizol法提取大鼠肺組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。用real-time PCR法檢測大鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)水平。PCR反應(yīng)體系為25 μL(cDNA 1 μL, 2.5 mmol/L dNTP 1 μL，5 pmol/L TaqMan探針1 μl，ROX 0.5 μL，7.5 pmol/L上、下游引物混合物1 μL，10× PCR 緩沖液2.5 μL以及DNA聚合酶0.25 μL)。用β-actin為內(nèi)參照校正Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)水平。引物和探針序列見表1。

3.6 肺組織BMP-2含量的測定 ELISA法測定肺組織BMP-2含量，操作嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件分析，均數(shù)間比較采用單因素方差分析，2組之間的比較采用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 引物和探針序列

FAM: 5-carboxyfluorescein; TAMRA: 5-carboxytetramethylrhodamine.

結(jié) 果

1 IMD降低肺動(dòng)脈平均壓

分流組大鼠mPAP顯著升高(P<0.01)，IMD則使分流大鼠mPAP明顯降低(P<0.01)，見表2。

2 IMD降低肺中、小動(dòng)脈相對中膜厚度

與對照組相比，分流組大鼠肺中、小肌型動(dòng)脈RMT明顯升高(P<0.01)，IMD則使分流大鼠肺中、小肌型動(dòng)脈RMT明顯降低(P<0.05),見表2。

表2 大鼠血流動(dòng)力學(xué)及形態(tài)學(xué)指標(biāo)

mPAP: mean pulmonary artery pressure; PA: pulmonary artery；**P<0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsshunt group.

3 IMD減輕肺組織膠原沉積

與對照組相比，分流組大鼠肺組織勻漿羥脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯升高(P<0.01)。IMD則使分流大鼠肺組織勻漿羥脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量明顯降低(P<0.01)，見表3。

4 IMD減少肺組織前膠原合成

與對照組相比，分流組大鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原 mRNA水平明顯升高(P<0.05)。IMD則使分流大鼠肺組織Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA水平明顯降低(P<0.05)，見圖1。

5 IMD降低肺組織BMP-2含量

與對照組相比，分流組大鼠肺組織BMP-2明顯升高(P<0.01)。IMD則使分流大鼠肺組織BMP-2含量明顯降低(P<0.05)，見表3。

表3 肺組織羥脯氨酸、Ⅰ、Ⅲ 型膠原及BMP-2含量

BMP-2: bone morphogenetic protein-2.**P<0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsshunt group.

Figure 1.The expression of procollagen Ⅰ (A) and Ⅲ(B) mRNA in the lung of rats. Mean±SD.n=6～7.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;△P<0.05,△△P<0.01vsshunt group.

圖1 肺組織I、III型前膠原mRNA的表達(dá)

討 論

肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)是高肺血流性肺動(dòng)脈高壓發(fā)生的重要病理生理基礎(chǔ)[7]，其主要特征是肺血管內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞異常增殖，細(xì)胞外基質(zhì)重塑，血栓和纖維化形成。肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)和肺動(dòng)脈高壓的程度是影響先天性心臟病治療時(shí)機(jī)和預(yù)后的重要因素[8]。目前關(guān)于高肺血流性肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)的形成機(jī)制尚不完全清楚，眾多血管活性物質(zhì)可能參與了其發(fā)生發(fā)展[9]。

IMD是Roh等[10]2004年在硬骨魚體內(nèi)發(fā)現(xiàn)一種血管活性肽，為降鈣素基因相關(guān)肽超家族的一員，可非選擇性地與三型降鈣素受體樣受體/受體活性調(diào)節(jié)蛋白受體復(fù)合物結(jié)合，從而發(fā)揮其舒張血管，減輕缺血再灌注損傷的作用。研究顯示，IMD可呈劑量依賴性地舒張肺血管，降低肺動(dòng)脈壓力[1]。在慢性低氧所致的肺動(dòng)脈高壓大鼠模型中，肺組織IMD及其受體表達(dá)增多[11]，新近研究表明IMD可抑制低氧所致的大鼠肺血管平滑肌細(xì)胞增殖和肺血管重構(gòu)的發(fā)生[12]。以上研究結(jié)果提示，IMD參與了低氧性肺動(dòng)脈高壓的病理生理過程。我們課題組新近應(yīng)用皮下埋置微量滲透泵的方法，對腹主動(dòng)脈-下腔靜脈分流大鼠外源性應(yīng)用IMD，發(fā)現(xiàn)IMD亦可緩解大鼠高肺血流性肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)的發(fā)生[2]。但I(xiàn)MD緩解大鼠高肺血流性肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)的機(jī)制尚不清楚。

膠原是肺血管細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成部分。肺血管壁的膠原成分主要是Ⅰ型和Ⅲ型膠原，其中Ⅰ型膠原與抗張力有關(guān)，Ⅲ型膠原與血管壁的彈性有關(guān)。膠原代謝異常使Ⅰ、Ⅲ型膠原絕對和相對含量改變，可導(dǎo)致肺動(dòng)脈管壁增厚，管腔變小，血管順應(yīng)性下降，最終導(dǎo)致肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)和肺動(dòng)脈高壓的形成[3]。有研究發(fā)現(xiàn)，在膽固醇誘導(dǎo)的心肌纖維化的大鼠模型中，外源性應(yīng)用IMD可減少心肌成纖維細(xì)胞膠原合成，抑制心肌纖維化的形成[13]，提示IMD具有調(diào)節(jié)膠原合成的作用。但I(xiàn)MD對高肺血流大鼠肺組織膠原合成和沉積的作用，以及IMD對于肺組織膠原合成和沉積的作用是否參與了其對高肺血流性肺動(dòng)脈高壓和肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)形成的調(diào)節(jié)機(jī)制尚不清楚。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)分流大鼠肺組織羥脯氨酸和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量升高，IMD則使分流大鼠肺組織膠原沉積減輕。提示IMD可通過抑制肺組織膠原沉積，緩解肺血管基質(zhì)重塑，從而減輕高肺血流性肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)和肺動(dòng)脈高壓。

IMD緩解肺組織膠原沉積的機(jī)制尚不清楚。膠原合成和降解失衡導(dǎo)致膠原絕對和相對含量的改變是肺組織膠原沉積增多的重要原因。IMD是否可通過抑制膠原合成緩解高肺血流大鼠肺組織膠原沉積目前尚不清楚。我們的研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IMD在緩解高肺血流大鼠肺組織膠原沉積的同時(shí)，可降低Ⅰ、Ⅲ型前膠原mRNA表達(dá)。提示IMD可能通過抑制肺組織膠原合成，從而抑制膠原沉積，緩解高肺血流性肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)和肺動(dòng)脈高壓的形成。

BMP-2是轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor β，TGF-β)超家族的一員，可通過Smads信號通路發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)合成的作用。多項(xiàng)研究表明，BMP-2通路的改變參與了肺動(dòng)脈高壓和肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)的發(fā)生。既往研究表明，外源性應(yīng)用BMP-2可抑制肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖和內(nèi)皮素-1(endothelin-1, ET-1)誘導(dǎo)的肺成纖維細(xì)胞α-平滑肌肌動(dòng)蛋白表達(dá)及成纖維細(xì)胞遷移[14-15]。BMP-2基因雜合缺失的小鼠肺血管阻力增高，且在炎癥、低氧和血清素刺激下更易發(fā)生肺動(dòng)脈高壓[16]。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IMD在緩解高肺血流大鼠肺組織膠原生成和沉積以及肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)的同時(shí)，可使高肺血流大鼠肺組織BMP-2蛋白含量明顯下降，提示IMD 抑制高肺血流大鼠肺組織膠原生成與肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)的作用可能與BMP-2通路有關(guān)。由于機(jī)體是多種體液因素參與的復(fù)雜的整體，IMD對于BMP-2通路的具體影響和調(diào)節(jié)途徑尚需進(jìn)一步研究。

總之，我們的研究結(jié)果顯示，IMD通過抑制肺組織膠原合成和堆積，從而緩解高肺血流性肺動(dòng)脈高壓和肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)的形成，此作用可能與BMP-2通路有關(guān)。這為高肺血流性肺動(dòng)脈高壓的臨床治療提供了新的思路。

[1] Burak-Kandilci H, Gumusel B, Wasserman A, et al. Intermedin /adrenomedullin-2 dilates the rat pulmonary vascular bed: dependence on CGRP receptors and nitric oxide release[J]. Peptides, 2006, 27(6):1390-1396.

[2] 龐璐璐, 齊建光, 高 揚(yáng), 等. 中介素減輕大鼠高肺血流性肺血管結(jié)構(gòu)重構(gòu)[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床, 2013, 33(10):1045-1049.

[3] 杜軍保，唐朝樞.肺動(dòng)脈高壓[M]. 第1版. 北京:北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社，2010：30-31．

[4] Qi J, Du J, Tang X, et al. The upregulation of endothelial nitric oxide synthase and urotensin-II is associated with pulmonary hypertension and vascular diseases in rats produced by aortocaval shunting[J]. Heart Vessels, 2004, 19(2):81-88.

[5] Bing W, Junbao D, Jianguang Q, et al. L-Arginine impacts pulmonary vascular structure in rats with an aortocaval shunt[J]. J Surg Res, 2002, 108(1):20-31.

[6] Barth PJ, Kimpel C, Roy S, et al. An improved mathematical approach for the assessment of the medial thickness of pulmonary arteries[J]. Pathol Res Pract,1993, 189(5):567-576.

[7] 陳傳斯, 龐玉生. 鈣激活性氯離子通道與高肺血流性肺動(dòng)脈高壓[J]. 中國病理生理雜志, 2012, 28(12):2297-2300.

[8] 張曉榮，戎小平. 先天性心臟病合并肺動(dòng)脈高壓患兒手術(shù)前后血漿硫化氫及血紅素氧合酶-1的變化及意義[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(7):1301-1305.

[9] 徐東江, 朱廣瑾. 幾種肺動(dòng)脈高壓相關(guān)因子的研究進(jìn)展[J]. 中國病理生理雜志, 2010, 26(4):819-822.

[10]Roh J, Chang CL, Bhalla A, et al. Intermedin is a calcitonin/calcitonin gene-related peptide family peptide acting through the calcitonin receptor-like receptor/receptor activity-modifying protein receptor complexes[J]. J Biol Chem, 2004, 279(8):7264-7274.

[11]龔永生，范小芳，吳小脈，等．Intermedin /adrenomedullin 2及其受體在慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓大鼠右心室的變化[J]．生理學(xué)報(bào), 2007, 59(2):210-214.

[12]Mao SZ, Fan XF, Xue F, et al. Intermedin modulates hypoxic pulmonary vascular remodeling by inhibiting pulmonary artery smooth muscle cell proliferation[J]. Pulm Pharmacol Ther, 2014, 27(1):1-9.

[13]Yang X, Zhang H, Jia Y, et al. Effects of intermedin1-53 on myocardial fibrosis[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2013, 45(2):141-148.

[14]Shlyonsky V, Soussia IB, Naeije R, et al. Opposing effects of bone morphogenetic protein-2 and endothelin-1 on lung fibroblast chloride currents[J]. Am J Respir Cell Mol Biol, 2011, 45(6):1154-1160.

[15]Zhang Y, Lu W, Yang K, et al. Bone morphogenetic protein 2 decreases TRPC expression, store-operated Ca2+entry, and basal [Ca2+]iin rat distal pulmonary arterial smooth muscle cells[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2013, 304(9):C833-C843.

[16]Anderson L, Lowery JW, Frank DB, et al. Bmp2 and Bmp4 exert opposing effects in hypoxic pulmonary hypertension[J]. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol, 2010, 298(3):R833-R842.

Intermedin inhibits pulmonary collagen synthesis in rats with pulmonary hypertension induced by high pulmonary blood flow

PANG Lu-lu, QI Jian-guang, GAO Yang, JIN Hong-fang, DU Jun-bao

(DepartmentofPediatrics,FirstHospitalofPekingUniversity,Beijing100034,China.E-mail:qijianguang@sohu.com)

AIM: To explore the regulatory effect of intermedin (IMD) on pulmonary collagen synthesis and accumulation in rats with pulmonary hypertension induced by high pulmonary blood flow.METHODS: Healthy male SD rats (n=20) were randomly divided into control group (n=7), shunt group (n=7) and shunt with IMD group (n=6). The shunting of abdominal aorta and inferior vena cava was produced in rats of shunt group and shunt with IMD group. After 8 weeks, IMD was administered into the rats of shunt with IMD group subcutaneously by mini-osmotic pump for 2 weeks. Mean pulmonary artery pressure (mPAP), relative medial thickness (RMT) of pulmonary arteries, contents of hydroxyproline, collagen type I and III, bone morphogenetic protein-2 (BMP-2), and the mRNA expression of procollagen I and III in lung tissues were measured and compared. RESULTS: Compared with control group, mPAP and RMT of medium and small pulmonary arteries in the rats of shunt group were significantly increased. Meanwhile, the lung hydroxyproline, collagens I and III and BMP-2 contents, and the mRNA expression of lung procollagen I and III were all significantly increased compared with control group. However, IMD significantly decreased mPAP, alleviated the changes of pulmonary vascular micro-structure, decreased the collagen accumulation and pulmonary tissue homogenate BMP-2 contents, and inhibited the mRNA expression of procollagen I and III in the lung tissue of shunting rats.CONCLUSION: IMD plays a protective role in the development of pulmonary hypertension and pulmonary vascular structural remodeling induced by high blood flow by inhibiting pulmonary collagen synthesis and accumulation, possibly in association with the BMP-2 pathway.

Pulmonary hypertension; High pulmonary blood flow; Collagen; Intermedin

1000- 4718(2014)12- 2185- 05

2014- 07- 02

2014- 08- 22

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(No.30973226)

R363.2

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.012

△通訊作者 Tel: 010-83573238; E-mail: qijianguang@sohu.com