過表達(dá)腦紅蛋白通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路防治AD的體外研究*

楊 軍， 戴頌陽， 向 月， 張 雄

(重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心，重慶市神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

過表達(dá)腦紅蛋白通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路防治AD的體外研究*

楊 軍， 戴頌陽， 向 月， 張 雄△

(重慶醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)科學(xué)研究中心，重慶市神經(jīng)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶 400016)

目的： 探索過表達(dá)腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)對(duì)轉(zhuǎn)染了pAPPswe的SH-SY5Y細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制。方法: 成功構(gòu)建過表達(dá)NGB的質(zhì)粒pEGFP-NGB并轉(zhuǎn)染入已預(yù)先轉(zhuǎn)染了pAPPswe的SH-SY5Y細(xì)胞，MTT法檢測(cè)過表達(dá)NGB對(duì)該細(xì)胞存活率的影響；JC-1法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位的影響；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)過表達(dá)NGB對(duì)細(xì)胞凋亡的影響；Western blotting法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞中p-Akt、 Akt和caspase-3/9表達(dá)的影響；ELISA法檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞內(nèi)Aβ42生成的影響。結(jié)果: MTT結(jié)果顯示，與對(duì)照組和空質(zhì)粒組比較，轉(zhuǎn)染NGB后，pAPPswe-SH-SY5Y細(xì)胞的存活率明顯提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。JC-1染色結(jié)果顯示過表達(dá)NGB能夠明顯抑制轉(zhuǎn)染pAPPswe對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞線粒體膜電位的降低作用(P<0.05)。流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示過表達(dá)NGB能夠抑制早、晚期細(xì)胞的凋亡。而Western blotting顯示過表達(dá)NGB不僅能抑制細(xì)胞內(nèi)caspase-3和caspase-9蛋白水平的表達(dá)，而且還能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)p-Akt蛋白的表達(dá)，而這種促進(jìn)作用能夠被PI3K/Akt的抑制劑LY294002所抑制。ELISA結(jié)果顯示過表達(dá)NGB能夠明顯抑制細(xì)胞內(nèi)Aβ42的生成。結(jié)論: 過表達(dá)NGB能夠顯著抑制pAPPswe誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，而且還抑制與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的caspase-3和caspase-9等蛋白表達(dá)。NGB的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路來實(shí)現(xiàn)的。

腦紅蛋白； SH-SY5Y細(xì)胞； 細(xì)胞凋亡； Caspase-3/9； PI3K/Akt信號(hào)通路

眾所周知，神經(jīng)元的丟失是阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)的主要的病理特征之一，而神經(jīng)元丟失的主要表現(xiàn)為神經(jīng)元的凋亡[1]。盡管，AD中神經(jīng)元凋亡的機(jī)制仍舊不清，但多數(shù)學(xué)者認(rèn)為β淀粉樣蛋白(β-amyloid protein, Aβ)在腦組織中的積聚是各種原因誘發(fā)AD的共同通路，也是誘發(fā)神經(jīng)元凋亡并導(dǎo)致AD認(rèn)知功能障礙關(guān)鍵因素[2]。因此，如何抑制Aβ的產(chǎn)生以及降低Aβ誘導(dǎo)的神經(jīng)元的凋亡可能成為防治AD的重要策略[3]。腦紅蛋白(neuroglobin，NGB)是一種廣泛存在于腦內(nèi)的新型攜氧球蛋白，由德國科學(xué)家Burmester等[4]于2000年發(fā)現(xiàn)。該蛋白具有廣泛的內(nèi)源性腦保護(hù)功能：不僅對(duì)由于缺血、缺氧引起的腦損傷有保護(hù)功能(如腦卒中)[5]，而且對(duì)非缺血缺氧性的腦損傷也有保護(hù)功能(如神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病AD)[6]。但具體的保護(hù)調(diào)控機(jī)制目前尚不清楚。本實(shí)驗(yàn)以pAPPswe轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞建立AD模型，觀察過表達(dá)NGB對(duì)細(xì)胞的神經(jīng)保護(hù)作用，并探討其分子調(diào)控機(jī)制，為治療AD提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 細(xì)胞及質(zhì)粒

神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y細(xì)胞由重慶醫(yī)科大學(xué)病理生理教研室湯為學(xué)教授惠贈(zèng)；pAPPswe質(zhì)粒由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院宋偉宏教授惠贈(zèng)；pEGFP-NGB質(zhì)粒以及空質(zhì)粒均由上海吉?jiǎng)P公司提供。NGB基因片段序列為：5’-TCC GCT CGA GCT ATG GAG CGC CCG GAG CCC GA-3’; 5’-ATC GGG ATC CTT ACT CGC CAT CCC AGC CTC GA-3’。

2 主要試劑

DMEM高糖培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶購自HyClone；JC-1線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒、MTT和SDS-PAGE凝膠配置試劑盒和青霉素-鏈霉素雙抗購自碧云天生物技術(shù)研究所；PRO-PREPTM蛋白提取液購自北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；PVDF膜購自Millipore；PageRulerTMPrestained Protein Ladder購自 Fermentas；多克隆兔抗人caspase-3和caspase-9抗體購自Bioworld；單克隆兔抗人Akt和p-Akt抗體和HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；Lipo2000購自Invitrogen；ECL發(fā)光試劑盒購自Bio-Rad；免疫組化試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物技術(shù)有限公司；ELISA試劑盒購自Biosourse。

3 主要實(shí)驗(yàn)方法

3.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將凍存的SH-SY5Y細(xì)胞37 ℃復(fù)蘇至培養(yǎng)瓶中，用含10%胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，置37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

3.2 pEGFP-NGB細(xì)胞轉(zhuǎn)染 當(dāng)已經(jīng)轉(zhuǎn)染了pAPPswe的SH-SY5Y細(xì)胞單層融合率達(dá)85%以上時(shí)，棄培養(yǎng)液，取8 μg 質(zhì)粒pEGFP-NGB加入0.75 mL無抗生素?zé)o血清的DMEM培養(yǎng)液中混勻；取30 μL Lipo2000加入0.75 mL無抗生素?zé)o血清的DMEM培養(yǎng)液中混勻，室溫靜置5 min；再將兩管液體輕混，室溫靜置20 min后加入含7.5 mL無抗生素?zé)o血清的DMEM培養(yǎng)液中，繼續(xù)培養(yǎng)6～8 h后，更換正常細(xì)胞所需DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)孵育24 h[7]。

3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 將SH-SY5Y細(xì)胞稀釋至1×107/L，然后按每孔500 μL體積的細(xì)胞懸液接種于96孔板中，分為對(duì)照組(已轉(zhuǎn)染pAPPswe)、轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組(vector組)及轉(zhuǎn)染pEGFP-NGB組(pNGB組)。待細(xì)胞貼壁24 h后，向各孔中分別加入50 μL MTT，于37 ℃培養(yǎng)箱中溫育4 h。棄去各孔中的DMEM培養(yǎng)基和MTT，在所有孔中各加入200 μL DMSO，振蕩混勻后，用酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測(cè)其吸光度(A490)。按下式計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率(%)= 實(shí)驗(yàn)組A490值/對(duì)照組A490值×100%。

3.4 線粒體膜電位的檢測(cè) 采用JC-1法。實(shí)驗(yàn)分組同MTT法，加入JC-1染料共同孵育30 min，PBS洗滌細(xì)胞3次，收集細(xì)胞，采用ND-1000熒光分光光度計(jì)檢測(cè)JC-1單體時(shí)，激發(fā)光設(shè)置為490 nm，發(fā)射光設(shè)置為530 nm；檢測(cè)JC-1聚合物時(shí)，激發(fā)光設(shè)置為525 nm，發(fā)射光設(shè)置為590 nm，激發(fā)波長為485 nm。所有的數(shù)值均以590 nm處(紅光)的吸光度/530 nm處(綠光)的吸光度表示,即用紅綠熒光的比值來衡量線粒體去極化的比例。

3.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè) 1×107/L的轉(zhuǎn)染pAPPswe的SH-SY5Y細(xì)胞接種于6孔板，經(jīng)過不同處理后，用預(yù)冷的PBS液沖洗細(xì)胞2遍，加入Annexin V-FITC和PI的混合液，置于室溫、避光環(huán)境下孵育15 min，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

3.6 Western blotting 分別收集對(duì)照組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組、pNGB組以及pNGB+LY294002組的細(xì)胞，加入100 μL蛋白裂解液，-20 ℃放置20 min，13 000 r/min離心5 min，收集上清，Bradford法檢測(cè)蛋白濃度。8%～12%的SDS-PAGE分離后，轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，以含0.5 g/L脫脂奶粉TBST液室溫封閉1 h，加入兔抗人caspase-3(1∶250)、caspase-9抗體(1∶ 250)、Akt(1∶500)、p-Akt(1∶500)和β-actin抗體(1∶ 5 000)，4 ℃孵育過夜；用TBST洗滌3次，加入HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(1∶5 000)，室溫孵育2 h，ECL法顯影，并用凝膠化學(xué)成像分析儀記錄其灰度值。

3.7 ELISA法檢測(cè)Aβ42的生成 按照說明書收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液1 mL，加入20 μL 廣譜蛋白酶抑制劑Protease Inhibitor Cocktail Set Ⅰ，至終濃度為1 mmol/L，分裝保存于-20 ℃。取出已包被的96孔板，加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)樣品每孔各50 μL(每個(gè)樣品設(shè)置5個(gè)復(fù)孔)，立刻加入50 μL detection antibody同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組，橡皮膏條封存，置室溫3 h。洗滌4遍后，甩掉板中液體后向每孔加入100 μL anti-rabbit IgG-HRP工作液, 橡皮膏條封存，置室溫30 min；再洗板4遍，甩掉板中液體，每孔加入100 μL stabilized chromogen, 液體變藍(lán)，橡皮膏條封存，置室溫避光30 min；然后每孔加入100 μL stop solution,終止顯色，此時(shí)藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色；最后用酶標(biāo)儀在450 nm波長下讀取吸光度(A)值，然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出Aβ42的濃度。

4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，應(yīng)用SPSS 15.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)及方差齊性檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 過表達(dá)NGB提高轉(zhuǎn)染pAPPswe的SH-SY5Y細(xì)胞的存活率

MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pAPPswe的SH-SY5Y細(xì)胞)的存活率為0.687±0.098，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的存活率為0.704±0.053，與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而pNGB組細(xì)胞的存活率為0.883±0.074，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖1。

Figure 1.The effect of NGB over-expression on the survival of SH-SY5Y cells transfected with pAPPswe. Mean±SD.n=6.**P<0.01vscontrol or vector.

圖1 過表達(dá)NGB對(duì)轉(zhuǎn)染pAPPswe的SH-SY5Y細(xì)胞存活率的影響

2 過表達(dá)NGB提高轉(zhuǎn)染pAPPswe的SH-SY5Y細(xì)胞的線粒體膜電位

線粒體膜電位的降低通常被認(rèn)為是細(xì)胞凋亡的早期現(xiàn)象。本實(shí)驗(yàn)JC-1法檢測(cè)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞紅綠熒光的比值為(50.7±3.5)%，空質(zhì)粒組紅綠熒光的比值為(52.4±4.2)%，2組比較無顯著差異；轉(zhuǎn)染pNGB后，過表達(dá)的NGB使細(xì)胞線粒體膜電位顯著提高，其紅綠熒光的比值為(76.5±5.9)%，與對(duì)照組和空質(zhì)粒組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖2。

Figure 2.The effect of NGB over-expression on the mitochondrial membrane potential in pAPPswe-transfected SH-SY5Y cells. Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol or vector.

圖2 過表達(dá)NGB對(duì)轉(zhuǎn)染pAPPswe的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)線粒體膜電位的影響

3 過表達(dá)NGB減少轉(zhuǎn)染pAPPswe的SH-SY5Y細(xì)胞的凋亡

流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，對(duì)照組細(xì)胞早期凋亡率為(0.78±0.27)%，空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組為(0.93±0.33)%，兩者比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而轉(zhuǎn)染pNGB組細(xì)胞早期凋亡率為(0.24±0.11)%，與上述2組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。而3組細(xì)胞的晚期凋亡率分別為(4.43±1.50)%、(4.04±0.59)%和(2.53±1.03)%，pNGB組與其它2組比較，差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖3。

4 過表達(dá)NGB通過激活PI3K/Akt通路抑制轉(zhuǎn)染pAPPswe的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)caspase-3和caspase-9蛋白的表達(dá)

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組和空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組比較，pNGB組細(xì)胞內(nèi)的caspase-3和caspase-9蛋白水平明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；p-Akt的表達(dá)水平則明顯增高(P<0.01)；而Akt的表達(dá)沒有顯著變化(P>0.05)。在使用PI3K/Akt特異性抑制劑LY294002處理后，細(xì)胞內(nèi)的caspase-3和caspase-9蛋白水平明顯增高，而p-Akt蛋白表達(dá)水平卻降低，與pNGB轉(zhuǎn)染組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，見圖4。

Figure 3.The effect of NGB over-expression on the apoptosis of pAPPswe-transfected SH-SY5Y cells detected by flow cytometric analysis.

圖3 過表達(dá)NGB對(duì)轉(zhuǎn)染pAPPswe的SH-SY5Y細(xì)胞凋亡的影響

Figure 4.Effects of NGB over-expression on the protein levels of caspase-3, caspase-9, Akt and p-Akt in pAPPswe-transfected SH-SY5Y cells.A: the protein levels of caspase-3, caspase-9, Akt and p-Akt determined by Western blotting; B: the quantitative analysis of relativeAvalues of caspase-3, caspase-9, Akt and p-Akt.Mean±SD.n=4.**P<0.01vscontrol or pNGB+LY 294002.

圖4 過表達(dá)NGB對(duì)轉(zhuǎn)染pAPPswe的SH-SY5Y細(xì)胞內(nèi)caspase-3、caspase-9、Akt和p-Akt蛋白水平的影響

5 過表達(dá)NGB明顯降低Aβ42生成

在正常的情況下或者腫瘤細(xì)胞內(nèi)，我們極少可以檢測(cè)到Aβ42。而如圖5顯示，在SH-SY5Y細(xì)胞轉(zhuǎn)染pAPPswe后，我們可以檢測(cè)到Aβ42的生成量約為(34.1±3.5) ng/L，這表明AD的細(xì)胞模型成功建立，進(jìn)而可以進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。在轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒后，Aβ42的生成量約為(33.5±4.7) ng/L，與對(duì)照組比較，兩者沒有顯著差異(P>0.05)。成功轉(zhuǎn)染NGB后，過表達(dá)的NGB可明顯降低Aβ42的生成，生成約為(21.3±2.5) ng/L，與對(duì)照組和空質(zhì)粒組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

討 論

人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y是一種具有低分化的腫瘤細(xì)胞。由于其增殖速度快，在形態(tài)上，生理和生化等功能上與人正常的神經(jīng)細(xì)胞相似，因此已作為一種經(jīng)典的體外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ捅粡V泛用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制[8]和藥物治療、預(yù)防機(jī)制[9]等的研究中。而在課題組前期的研究中[7]，我們利用pAPPswe轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞產(chǎn)生了可檢測(cè)到的Aβ，為探討curcumin抑制Aβ治療AD的潛在機(jī)制研究提供了可靠的AD的細(xì)胞模型。因此，本實(shí)驗(yàn)仍然利用pAPPswe轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞建立AD的細(xì)胞模型。本研究中，pAPPswe轉(zhuǎn)染SH-SY5Y細(xì)胞后，淀粉樣蛋白前體(amyloid protein precursor, APP)的活性增強(qiáng)，促進(jìn)了APP的裂解，不僅產(chǎn)生了可以被檢測(cè)到的Aβ42，而且也導(dǎo)致了細(xì)胞存活率的降低，線粒體膜電位也降低，細(xì)胞凋亡甚至導(dǎo)致細(xì)胞的死亡。這些都表明模型是建立成功的。在轉(zhuǎn)染NGB后，SH-SY5Y細(xì)胞過表達(dá)NGB能夠顯著提高細(xì)胞的存活率，恢復(fù)了線粒體膜電位的水平并且降低細(xì)胞的凋亡率，而且還降低了細(xì)胞上清中Aβ42的含量，這些都表明NGB對(duì)SH-SY5Y細(xì)胞具有神經(jīng)保護(hù)作用。

Figure 5.Over-expression of NGB significantly decreased the generation of Aβ42.Mean±SD.n=5.**P<0.01vscontrol or vector.

圖5 過表達(dá)NGB明顯降低Aβ42生成

眾所周知，凋亡的過程主要分為以下幾個(gè)階段：接受凋亡信號(hào)、凋亡調(diào)控分子間的相互作用、蛋白水解酶的活化、后進(jìn)入連續(xù)反應(yīng)過程。其中，caspases是特異性凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子，其激活被是凋亡發(fā)生機(jī)制中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)之一。Caspases家族成員眾多，其中caspase-8/9/10是凋亡的啟動(dòng)子，而caspase-3/6/7為凋亡的執(zhí)行者。研究已經(jīng)證實(shí)，caspase與AD密切相關(guān)。Li等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Aβ在引起星形膠質(zhì)細(xì)胞和小腦顆粒細(xì)胞凋亡的過程中， caspases-2、3、6活性增加，三者各自的抑制劑對(duì)Aβ誘導(dǎo)的凋亡起到明顯的保護(hù)作用，表明多種caspases參與了Aβ誘導(dǎo)的凋亡。Francois等[11]的研究證明，APP存在3個(gè)caspase-3的剪切位點(diǎn)：(P4)DNVD197(P1)/S、(P4) DYAD219(P1)/G和(P4)VEVD720(P1)/A。APP被caspases剪切后的胞內(nèi)羧肽片段C31參與Aβ誘導(dǎo)的凋亡。而Aβ誘導(dǎo)的凋亡又促進(jìn)caspases的激活和APP的裂解。Raina等[12]也發(fā)現(xiàn)在AD大腦皮層和海馬神經(jīng)元中caspase-3的活性與βAPP的斷裂，Aβ的升高及老年斑的形成是一致的。Caspases對(duì)βAPP的剪切破壞了細(xì)胞內(nèi)APP的正常代謝過程，向著生成Aβ的方向進(jìn)行，引起更多的Aβ生成和沉積，Aβ介導(dǎo)的毒性又促進(jìn)caspases對(duì)APP的裂解，從而形成惡性循環(huán)。因此，我們推測(cè)過表達(dá)NGB降低Aβ42的生產(chǎn)以及降低Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷的機(jī)制可能是通過抑制caspases的活性實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)NGB能夠明顯降低與凋亡密切相關(guān)的caspase-3和caspase-9蛋白水平的表達(dá)，這進(jìn)一步證實(shí)了線粒體凋亡途徑直接參與了Aβ誘導(dǎo)的凋亡過程，在AD的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，而NGB發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用與抑制caspase-3和caspase-9的活性進(jìn)而抑制凋亡的發(fā)生并且降低Aβ42的生成形成的良性循環(huán)有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)caspase-9是PI3K/Akt信號(hào)通路下游的靶基因[13]，應(yīng)用高濃度的PI3K抑制劑后會(huì)阻斷Akt的磷酸化，從而增強(qiáng)caspase-9蛋白的磷酸化，促進(jìn)其下游分子引起的一系列串聯(lián)反應(yīng)而加快凋亡進(jìn)程，而抑制神經(jīng)干細(xì)胞的存活[14]。新近的研究發(fā)現(xiàn)，NGB是PI3K/Akt信號(hào)通路的誘導(dǎo)劑[15]。因此我們認(rèn)為，NGB有可能是通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路，進(jìn)而抑制下游靶基因caspases的活性而抑制神經(jīng)元的凋亡，從而保護(hù)神經(jīng)元。在本實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)過表達(dá)NGB能夠降低caspase-3和caspase-9的蛋白水平表達(dá)，并且增加Akt磷酸化水平，而這種作用可以被PI3K/Akt信號(hào)通路的特異性抑制劑LY294002所拮抗，這說明PI3K/Akt通路參與了NGB抑制caspase-3和caspase-9的活性，促進(jìn)細(xì)胞的生長等過程。

綜上所述，過表達(dá)NGB不僅能夠減少Aβ的生成，而且還能夠削弱Aβ誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷，而其機(jī)制可能是通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路進(jìn)而抑制與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)的caspase-3、caspase-9等活性，這將為防治AD提供新的思路。

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Prevention and treatment of AD by over-expression of neuroglobin via activating PI3K/Akt signaling pathway

YANG Jun, DAI Song-yang, XIANG Yue, ZHANG Xiong

(InstituteofNeuroscience，ChongqingMedicalUniversity,ChongqingKeyLaboratoryofNeurobiology,Chongqing400016,China.E-mail:zhangxiong_0@aliyun.com)

AIM: To study the neuroprotective roles of neuroglobin (NGB) over-expression in the SH-SY5Y cells transfected with pAPPswe.METHODS: The plasmid pEGFP-NGB was successfully constructed and transfected into the SH-SY5Y cells, which were pretreated with pAPPswe. MTT assay was applied to detect the effect of NGB over-expression on the cell survival rates. JC-1 staining was used to detect the level of mitochondrial transmembrane potential. The cell apoptosis was analyzed by flow cytometry. The effects of NGB over-expression on the protein level of p-Akt, Akt and caspase-3/9 were determined by Western blotting. The generation of Aβ42in the cells was measured by ELISA.RESULTS: The cell survival rate was remarkably increased after transfection with NGB compared with control group and empty plasmid group (P<0.05). The over-expression of NGB significantly inhibited the decrease in mitochondrial membrane potential induced by pAPPswe. The over-expression of NGB inhibited the apoptosis of the cells. Furthermore, over-expression of NGB not only inhibited the expression of caspase-3 and caspase-9, but also induced the production of p-Akt, which was prevented by LY294002, an inhibitor of PI3K/Akt. The generation of Aβ42was inhibited in the cells with the over-expression of NGB. CONCLUSION: Over-expression of NGB significantly inhibits the SH-SY5Y cell injuries induced by pAPPswe and inhibits the expression of caspase-3/9, which is tightly related with cell apoptosis. Furthermore, the neuroprotective roles of NGB may be via activating PI3K/Akt signaling pathway.

Neuroglobin; SH-SY5Y cells; Apoptosis; Caspase-3/9； PI3K/Akt signaling pathway

1000- 4718(2014)12- 2166- 06

2014- 07- 18

2014- 09- 16

國家青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目 (No. 81100948)

R363； R749.1+6

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.009

△通訊作者 Tel: 023-68485898； E-mail: zhangxiong_0@aliyun.com