胰島素抗性對肝癌HepG2細胞生物學功能及順鉑敏感性的影響*

劉 鵬， 黃美松， 胡陽黔△

(1湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院消化內科，湖北 十堰 442008；2十堰市中西醫(yī)結合醫(yī)院內分泌科，湖北 十堰 442011)

胰島素抗性對肝癌HepG2細胞生物學功能及順鉑敏感性的影響*

劉 鵬1， 黃美松2， 胡陽黔1△

(1湖北醫(yī)藥學院附屬東風醫(yī)院消化內科，湖北 十堰 442008；2十堰市中西醫(yī)結合醫(yī)院內分泌科，湖北 十堰 442011)

目的： 研究胰島素抗性在原發(fā)性肝癌細胞中的生物學功能及對順鉑抗癌藥物的抗藥敏感性的影響。方法: 利用高濃度的胰島素連續(xù)培養(yǎng)HepG2細胞72 h獲得抗胰島素的HepG2細胞(HepG2/IR)，檢測HepG2/IR細胞的黏附、遷移和侵襲的能力改變以及對順鉑的敏感性；同時利用流式細胞術測定HepG2和HepG2/IR中胰島素受體和葡萄糖轉運蛋白2的表達情況。結果: 胰島素抗性HepG2/IR細胞中葡萄糖消耗量顯著降低；胰島素受體和葡萄糖轉運蛋白2表達下調；而HepG2/IR細胞的黏附、遷移和侵襲能力明顯增強；同時HepG2/IR細胞對順鉑的敏感性降低；但用吡格列酮處理HepG2/IR細胞后其黏附、遷移和侵襲能力顯著減弱。結論: 胰島素抗性與HepG2細胞的耐藥性、細胞黏附、遷移和侵襲能力密切相關。這有助于解釋具有胰島素抗性的癌癥患者對化療失敏的臨床現(xiàn)象。

HepG2細胞； 胰島素抵抗； 細胞凋亡； 細胞遷移； 順鉑

胰島素抗性(insulin resistance，IR)通常指機體、器官、組織或細胞對胰島素的敏感性降低[1]。IR可由一系列上游或下游事件誘導發(fā)生，如減少胰島素受體數(shù)量，降低胰島素與其受體的親和力，編碼胰島素或胰島素受體基因的突變，減少葡萄糖轉運蛋白的數(shù)量以及胰島素信號轉導通路的失活等[2-4]。而肝臟在糖、脂代謝中具有重要的地位，是IR的三大靶器官之一。大量研究結果表明IR是原發(fā)性肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)發(fā)生和發(fā)展過程中的一個重要風險指標和術后復發(fā)的重要預后因子[5-6]。HCC細胞復雜的抗藥性機制是傳統(tǒng)的化療方法難以將其徹底消除的重要因素，但關于IR與HCC多種抗藥性之間的關系尚未見研究；同時腫瘤細胞的黏附、侵襲和轉移的生物學功能與腫瘤的惡性程度也密切相關[7]，但IR對HCC生物學功能的影響研究也少見。因此本研究以肝癌細胞系HepG2為HCC的研究對象，建立胰島素抗性的肝癌細胞HepG2/IR，檢測細胞黏附、遷移和侵襲能力等細胞功能的改變及與常用抗癌藥物順鉑抗藥性之間的關系，從而明確IR與HCC細胞生物學功能的關系，以進一步驗證IR在HCC腫瘤發(fā)生發(fā)展及產生耐藥性中的重要地位。

材 料 和 方 法

1 試劑

HepG2細胞購自ATCC；DMEM高糖培養(yǎng)基購自Gibco；澳洲特級胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)購自天津康源生物技術有限公司；MTT試劑、抗生素(青霉素和鏈霉素)購自北京金博益生物技術有限公司；胰島素、胰島素受體抗體和葡萄糖轉運蛋白2抗體購自R&D；順鉑(cisplatin)和吡格列酮(pioglitazone，PIO)購自Sigma；Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；Transwell板購自Millipore。

2 方法

2.1 胰島素抗性HepG2/IR細胞模型的建立 人肝癌細胞HepG2培養(yǎng)于含有10%FBS、1%青霉素和1%鏈霉素的高糖型DMEM培養(yǎng)基中，當細胞密度達到80～90%左右時進行細胞傳代，細胞置于37 ℃、5% CO2的完全濕度培養(yǎng)箱中。胰島素抗性HepG2細胞株(HepG2/IR)的建立參考文獻中方法[10-11]，先用無血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2細胞6 h，再將0.5和1 μmol/L 胰島素分別處理 HepG2細胞48 h和72 h，隨后用無胰島素的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)72 h之后棄掉培養(yǎng)基，加入無酚紅的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。在倒置顯微鏡下觀察HepG2/IR 細胞在不同時期的形態(tài)變化。收集細胞培養(yǎng)液，采用GOD-POD法借助Hitachi 7600-020自動生化分析儀測定細胞培養(yǎng)液中的葡萄糖含量。為了消除活細胞代謝對檢測結果的影響，我們運用MTT法校正細胞對葡萄糖的消耗量，計算方式為葡萄糖消耗量/A值。

2.2 HepG2/IR細胞胰島素耐藥性穩(wěn)定性檢測 實驗組的HepG2/IR細胞和對照組的HepG2細胞經消化計數(shù)后分別接種于24孔板中培養(yǎng)24 h，棄掉培養(yǎng)基后加入終濃度為0.5 μmol/L 胰島素的DMEM培養(yǎng)基，細胞置于37 ℃、5% CO2的完全濕度培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)72 h，收集細胞上清，按上述方法測定細胞培養(yǎng)液中葡萄糖的消耗量，計算實驗組的HepG2/IR細胞和對照組的HepG2細胞的葡萄糖消耗量的比例，判定HepG2/IR細胞對胰島素耐藥性的穩(wěn)定性。

2.3 HepG2和HepG2/IR細胞胰島素受體和葡萄糖轉運蛋白2含量的測定 將對數(shù)生長期的HepG2和HepG2/IR細胞經消化處理后接種24孔板，培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)基，在不同組中各加入胰島素受體抗體(1∶50，1% BSA稀釋)和葡萄糖轉運蛋白受體的抗體(1∶50，1% BSA稀釋)，37 ℃孵育1 h，PBS洗滌，再加入含終濃度為0.5 μmol/L胰島素DMEM培養(yǎng)基，對照組為無胰島素的DMEM培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后收集細胞，加入熒光素標記的Ⅱ抗(1∶200，1% BSA稀釋)，37 ℃避光孵育30 min。用流式細胞儀測定2種細胞中胰島素受體和葡萄糖轉運蛋白2陽性細胞的比例和平均熒光強度。

2.4 Annexin V/PI染色測定細胞凋亡 將對數(shù)生長期的HepG2細胞，HepG2/IR細胞和PIO處理的HepG2/IR細胞經消化后接種到24孔板中，培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)基，加入含終濃度為16 mg/L順鉑的DMEM培養(yǎng)基作用48 h后收集細胞，PBS洗滌，按照Annexin V試劑盒說明書操作，先加入500 μL的binding buffer重懸細胞，再加入5 μL FITC標記的Annexin V和5 μL PI混勻，室溫下避光孵育15 min，運用流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2.5 MTT實驗測定細胞對順鉑的敏感性 將對數(shù)生長期的HepG2細胞，HepG2/IR細胞和PIO處理的HepG2/IR細胞經消化計數(shù)后，以細胞密度為1×108/L接種到96孔板中，培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)基，每孔加入含終濃度為16 mg/L順鉑，對照組不加順鉑，置于37 ℃、5% CO2的完全濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)44 h和68 h。每孔加入20 μL 5 g/L MTT，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄掉培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置于搖床上室溫振蕩5 min，用酶標儀測定490 nm處的A值。按下式計算細胞增殖抑制率：

細胞增殖抑制率(%)

由公式計算出順鉑對細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。

2.6 細胞黏附實驗 向96孔板中加入25 μL 200 mg/L人纖維連接蛋白，將96孔板置于37 ℃ 靜置1 h，PBS洗滌3次，室溫下晾干，再加入1% BSA (20 μL/well)。將96孔板置于37 ℃ 靜置1 h，PBS洗滌3次，室溫下晾干備用。將對數(shù)生長期的HepG2細胞、HepG2/IR細胞和PIO處理的 HepG2/IR細胞經0.25%的胰蛋白酶消化，以5×105cells/well接種于處理好的96孔板中(100 μL/well)，分別培養(yǎng)30 min和1 h后用PBS沖洗去未貼壁的細胞，運用MTT法測定490 nm處每孔細胞的A值，重復3次以上獨立重復試驗。按下式計算細胞黏附率：

2.7 細胞遷移和侵襲實驗 將生長良好的HepG2細胞、HepG2/IR細胞和PIO處理的HepG2/IR細胞用0.25%的胰酶消化，用含0.1% BSA的DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，然后在Transwells每個培養(yǎng)孔上室中加入2.5×104個細胞(100 μL/well)，置于37 ℃、5% CO2的完全濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)24 h。下室中加入600 μL含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)6 h后用4%多聚甲醛固定、乙醇脫水、結晶紫染色和洗滌。用棉簽輕輕擦去上室的貼壁細胞。每組細胞在Transwell實驗中設置3個重復孔。在顯微鏡下(×200倍)觀察每組從Transwell上室遷移至微孔膜下層的細胞。同時每個孔在顯微鏡下隨機選擇3個視野進行拍照，對遷移的細胞進行計數(shù)。細胞侵襲實驗參照文獻方法[12]，Transwell板不用包被人工基底膜，以細胞密度為5×108/L接種于上室中，后續(xù)步驟同細胞遷移實驗。

3 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，數(shù)據用均數(shù)±標準誤(mean±SEM)表示，組間均數(shù)比較分析采用t檢驗或方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 HepG2/IR細胞株的建立

觀察HepG2/IR細胞模型建立過程中細胞形態(tài)學的變化發(fā)現(xiàn)，胰島素最初作用于HepG2細胞時出現(xiàn)少部分死亡，部分細胞脫落且出現(xiàn)不規(guī)則狀態(tài)，隨后細胞形態(tài)趨于穩(wěn)定，細胞變小貼壁變牢固出現(xiàn)克隆生長，見圖1。測定細胞對葡萄糖的消耗量，結果顯示葡萄糖的消耗量隨著胰島素濃度的增加逐漸降低，并呈時間依賴效應，實驗組葡萄糖的消耗量與對照組比較有顯著差異(P<0.05)，這一作用在細胞暴露于胰島素72 h時最大，與對照組比較有顯著差異(P<0.01)，見圖2。我們通過計算相對葡萄糖的消耗量來觀察HepG2/IR細胞對胰島素耐藥性的穩(wěn)定性，以判斷HepG2/IR細胞是否發(fā)生對胰島素耐藥性失敏。結果表明HepG2/IR細胞在含有或不含有胰島素的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，相對葡萄糖的消耗量無明顯變化，與對照組比較無統(tǒng)計學差異，見圖3。根據實驗結果，選擇0.5 μmol/L胰島素處理細胞72 h作為后續(xù)實驗作用條件。

Figure 1.The morphological changes of HepG2/IR cell model (HepG2 cells were treated with 0.5 μmol/L insulin) (×100).

圖1 HepG2/IR細胞模型建立過程中細胞形態(tài)學變化

Figure 2.Glucose consumption of the HepG2 cells. The cells were treated for 48 h and 72 h with different concentrations of insulin. Mean±SEM.n=5.*P<0.05,**P<0.01vscontrol group.

圖2 HepG2細胞經不同濃度胰島素處理48 h和72 h時的葡萄糖消耗量

Figure 3.Relative glucose consumption of HepG2/IR cells in DMEM medium with or without insulin. Mean±SEM.n=5.

圖3 HepG2/IR細胞在含胰島素和不含胰島素的DMEM培養(yǎng)基的相對葡萄糖消耗量

2 HepG2/IR細胞中胰島素受體和葡萄糖轉運蛋白2表達下調

HepG2/IR細胞和HepG2細胞在無胰島素的DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后運用流式細胞術測定細胞中胰島素受體和葡萄糖轉運蛋白2的表達情況，與HepG2細胞相比，HepG2/IR細胞中胰島素受體和葡萄糖轉運蛋白2的表達量分別降低了(80.12±2.54)%和(25.60±3.73)%，見圖4。進一步研究結果表明HepG2/IR細胞對胰島素耐藥性至少能維持72 h。

Figure 4.The expression of glucose transporter 2 (Glut-2) and insulin receptor (InsR) in the HepG2/IR cells and HepG2 cells. Mean±SEM.n=5. PR: positive rate； MFI: mean fluorescence intensity.

圖4 HepG2/IR細胞和HepG2細胞中胰島素受體和葡萄糖轉運蛋白受體2的表達情況

3 HepG2/IR細胞對順鉑的敏感性降低

MTT結果顯示HepG2/IR細胞對順鉑的敏感性顯著降低，順鉑分別處理HepG2/IR細胞48 h和72 h后，HepG2/IR細胞對順鉑的半數(shù)抑制濃度分別為(17.80±0.37)mg/L和(11.35±0.66)mg/L，明顯高于HepG2細胞(P<0.01)，提示當HepG2/IR細胞產生胰島素耐藥性之后對順鉑表現(xiàn)出抗性。當HepG2/IR細胞暴露于10 mmol/L吡格列酮24 h時，HepG2/IR細胞對順鉑的敏感性恢復到HepG2細胞的水平，這時HepG2/IR細胞暴露于吡格列酮48 h和72 h時的半數(shù)抑制濃度分別為(12.68±0.37)mg/L和(7.10±0.36)mg/L，明顯低于HepG2/IR細胞，見圖5。用16 mg/L順鉑作用HepG2/IR細胞和HepG2細胞48 h后，流式細胞術的檢測結果顯示HepG2/IR細胞的凋亡率為(14.20±1.04)%，明顯低于HepG2細胞的凋亡率[(30.17±2.89)%，P<0.01]。當HepG2/IR細胞的胰島素耐藥性被吡格列酮中和后， HepG2/IR細胞的凋亡率增加為(26.00±2.06)%，與HepG2/IR細胞的凋亡率比較有顯著差異(P<0.01)，見圖6。研究結果表明HepG2/IR細胞對胰島素產生耐藥性之后，HepG2/IR細胞對順鉑也同樣產生抗性。因此，我們推斷HepG2細胞產生胰島素抗性是HepG2細胞對化療失敏的原因之一。

Figure 5.IC50of cisplatin for HepG2 cells, HepG2/IR cells and HepG2/IR cells treated with pioglitazone (PIO). Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsHepG2;&&P<0.01vsHepG2/IR.

圖5 順鉑對HepG2細胞、HepG2/IR細胞和PIO處理的HepG2/IR細胞的半數(shù)抑制濃度

Figure 6.The cell apoptotic rate detected by flow cytometry after cisplatin treatment for 48 h.A: HepG2 cells； B: HepG2 cells treated with cisplatin； C: HepG2/IR cells treated with cisplatin； D: HepG2/IR cells treated with cisplatin and PIO. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsB;&&P<0.01vsC.

圖6 流式細胞術檢測細胞經順鉑處理48 h后的細胞凋亡率

4 HepG2/IR細胞的黏附力顯著增強

HepG2和HepG2/IR細胞培養(yǎng)于人工基質膜蛋白的96孔板中，MTT結果顯示HepG2/IR細胞的黏附力顯著增強，與HepG2細胞相比HepG2/IR細胞分別培養(yǎng)30 min和1 h時的細胞黏附率分別提高到了(71.50±3.46)%和(72.80±5.37)%。相反，當用吡格列酮處理HepG2/IR細胞后，HepG2/IR細胞的黏附率顯著降低，HepG2/IR細胞經PIO分別作用30 min和1 h時，HepG2/IR細胞的黏附率分別降低了(22.40±2.58)%和(25.70±3.24)%(P<0.01)，結果證實HepG2/IR細胞的黏附力顯著增強，見圖7。

5 胰島素抗性促進HepG2/IR細胞的遷移和侵襲

Transwell遷移實驗證明胰島素抗性能促進HepG2/IR細胞的遷移和侵襲，與HepG2細胞比較，HepG2/IR細胞的遷移和侵襲能力顯著增加。經過計數(shù)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)HepG2/IR細胞的遷移和侵襲數(shù)量比HepG細胞的遷移和侵襲數(shù)量增加(1.67±0.23)倍和(1.58±0.31)倍(P<0.01)。但胰島素的耐藥性被吡格列酮中和后，HepG2/IR細胞的遷移和侵襲能力顯著降低，分別降低(33.15±2.34)% 和(35.21±3.21)%(P<0.05)。研究結果表明胰島素耐藥性能增強HepG2/IR細胞的遷移和侵襲能力，見圖8。

Figure 7.The adhesion of HepG2 cells and HepG2/IR cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsHepG2;##P<0.01 vsHepG2/IR.

圖7 HepG2細胞、HepG2/IR細胞和PIO處理的HepG2/IR細胞的黏附實驗

Figure 8.The migration and invasion of HepG2 cells and HepG2/IR cells detected by Transwell assay (×100). A: migration of HepG2 cells; B: migration of HepG2/IR cells; C: migration of PIO-treated HepG2/IR cells; D: invasion of HepG2 cells; E: invasion of HepG2/IR cells; F: invasion of PIO-treated HepG2/IR cells. Mean±SEM.n=5.**P<0.01vsHepG2;$$P<0.01vsHepG2/IR.

圖8 Transwell檢測HepG2細胞、HepG2/IR細胞和PIO處理的HepG2/IR細胞的遷移和侵襲實驗

討 論

機體活動能影響腫瘤形成過程中的所有階段[8]。葡萄糖代謝紊亂是惡性腫瘤的特征之一，機體或細胞中葡萄糖代謝紊亂導致機體或細胞胰島素的敏感性降低，進而產生胰島素抗藥性。因此，有學者提出將胰島素抗藥性視為多種惡性腫瘤的風險指標，控制機體或細胞對胰島素的抗藥性是降低腫瘤術后復發(fā)的一項重要手段[9]。大量研究證實胰島素抗藥性可促進腫瘤細胞增殖，值得注意的是機體或細胞對胰島素產生抗藥性之后對化療或化療藥物也產生抗性。研究證實[10]胰高血糖素能促進胰島素抗性細胞的增殖和抑制細胞凋亡，提示胰島素抗藥性作為新抗癌藥物研發(fā)和升級的參考依據。然而，癌細胞對胰島素抗藥性的生物學作用還不完全清楚。已有研究證實肝癌細胞對胰島素的敏感性降低是肝癌發(fā)生的病理學特征之一[11]。HepG2細胞是一種原發(fā)性肝癌細胞，具有正常肝細胞的一些特征，例如高表達胰島素受體。本研究將HepG2細胞暴露于高濃度的胰島素連續(xù)培養(yǎng)72 h后，成功建立胰島素抗性細胞株——HepG2/IR細胞株。結果顯示HepG2/IR細胞對葡萄糖的消耗量顯著偏低，胰島素受體和葡萄糖轉運蛋白受體的表達量顯著下調，這些特征即為胰島素抗藥性典型的特征。

由于肝癌細胞本身對一些抗癌藥物敏感性低以及復雜的抗藥性機制使得傳統(tǒng)的化療方法難以將其徹底消除。本研究發(fā)現(xiàn)胰島素抗性能降低HepG2細胞對順鉑的敏感性，從而抑制細胞凋亡。吡格列酮是一種胰島素增敏劑，常用來增強脂肪細胞，骨骼肌細胞和肝臟組織對胰島素的敏感性。研究發(fā)現(xiàn)中和胰島素抗性之后，腫瘤細胞對葡萄糖的消耗量顯著增加[12]。我們的研究發(fā)現(xiàn)HepG2/IR細胞可誘導其對順鉑產生抗藥性，而這一作用可通過吡格列酮得以消除。

腫瘤細胞的黏附、遷移和侵襲是癌癥復發(fā)和轉移最直接的原因，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細胞的黏附、遷移和侵襲性與肝癌患者術后差有密切相關[13-14]。肝癌患者對胰島素產生抗性后，胰島素抗性能促進組織的纖維化，加速肝硬化和高瘦素血癥進程，進而促進腫瘤壞死因子的表達，最終導致肝癌患者的預后差[15]。我們的研究首次發(fā)現(xiàn)胰島素抗性直接影響肝癌細胞的遷移，結果顯示胰島素抗性能增強HepG2/IR細胞的黏附、遷移和侵襲能力，從而降低HepG2/IR細胞對順鉑的敏感性。然而，當HepG2/IR細胞對胰島素的抗性被吡格列酮消除之后，HepG2/IR細胞的黏附、遷移和侵襲能力顯著被抑制。因此，本研究結果顯示胰島素抗藥性與肝癌患者對化療或化療藥物失敏以及預后性差存在密切關系，提示肝癌細胞對胰島素的抗性可作為預測肝癌發(fā)展的指標之一，給患者提供最佳的治療時間和方法。

綜上所述，本研究成功建立了胰島素抗性肝癌細胞株HepG2/IR，肝癌細胞對胰島素產生抗性之后，對一些化療藥物也同樣產生抗藥性。我們的研究結果顯示HepG2細胞對胰島素產生抗性后，細胞的黏附、遷移和侵襲能力顯著增強?；谖覀兊难芯拷Y果，胰島素抗性是肝癌患者對化療失敏的重要原因。因此，降低胰島素抗性將提高肝癌細胞對化療藥物的敏感性，進而抑制肝癌細胞發(fā)生轉移，最終實現(xiàn)治療肝癌的目的。

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Effect of insulin resistance on biological function of HepG2 cells and sensitivity to cisplatin

LIU Peng1, HUANG Mei-song2, HU Yang-qian1

(1DepartmentofGastroenterology,TheAffiliatedDongfengHospital,HubeiUniversityofMedicine,Shiyan442008,China;2DepartmentofEndocrinology,ShiyanHospitalofIntegratedTraditionalandWesternMedicine,Shiyan442011,China.E-mail:huyangqian999@163.com)

AIM: To investigate the effect of insulin resistance (IR) on the biological function of hepatocellular carcinoma (HCC) and sensitivity to cisplatin. METHODS: IR was induced in HepG2 cells via incubation with a high concentration of insulin. Afterwards, the effects of IR on adhesion, migration, invasion and sensitivity to cisplatin of the cells were detected.RESULTS: The results indicated that glucose consumption was reduced in the IR cells. The expression of the insulin receptor and glucose transporter 2 was down-regulated. Furthermore, HepG2/IR cells displayed markedly enhanced adhesion, migration, and invasion. These cells exhibited a lower sensitivity to cisplatin. On the contrary, HepG2/IR cells exhibited decreased adhesion and invasion after treatment with the insulin sensitizer pioglitazone hydrochloride.CONCLUSION: IR is closely related to drug resistance, adhesion, migration and invasion in HepG2 cells. These findings may help explain the clinical observation of the limited efficacy of chemotherapy on a background of IR.

HepG2 cells; Insulin resistance; Apoptosis; Cell migration; Cisplatin

1000- 4718(2014)12- 2148- 07

2014- 07- 14

2014- 09- 02

湖北省教育廳指導項目(No. B2014054)

R73-3

A

10.3969/j.issn.1000- 4718.2014.12.006

△通訊作者 Tel: 0719-8272546； E-mail： huyangqian999@163.com