Q61R和V112A突變的HRAS基因在NIH小鼠體內(nèi)誘發(fā)腫瘤的實(shí)驗(yàn)研究

張 峰，趙 龍，樊金萍吳雪伶孟淑芳*

（1.中國(guó)食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.包頭市腫瘤醫(yī)院，內(nèi)蒙古 包頭 014030）

腫瘤細(xì)胞基因組DNA及其片段可在體外試驗(yàn)中轉(zhuǎn)化NIH 3T3細(xì)胞，使其獲得體內(nèi)致瘤能力，腫瘤細(xì)胞基因組DNA中具有轉(zhuǎn)化能力的基因被稱(chēng)為癌基因。HRAS屬于RAS基因家族（包括HRAS、KRAS和NRAS），通過(guò)與GTP/GDP結(jié)合，RAS蛋白作為分子開(kāi)關(guān)調(diào)節(jié)與細(xì)胞存活和增殖相關(guān)的RAF-MEK-ERK、PI3K/AKT等信號(hào)傳導(dǎo)通路，HRAS突變與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)[1]。體內(nèi)外試驗(yàn)中，雖然Q61L突變的HRAS（T24-HRAS）可在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中誘發(fā)尿路上皮癌[2]，但正常HRAS基因需要其他癌基因（如SV40的大T抗原或cMYC基因）的輔助才能轉(zhuǎn)化細(xì)胞[3]。2008年，Li等使用分別表達(dá)T24-HRAS和cMYC的混合質(zhì)粒首次在NIH小鼠中誘發(fā)皮膚腫瘤，劑量為每只12.5μg時(shí)，腫瘤發(fā)生率分別為20%（成年小鼠）和82%（乳鼠）。使用同時(shí)表達(dá)T24-HRAS和cMYC的單一質(zhì)粒，腫瘤發(fā)生率提高至40%（成年小鼠）和100%（乳鼠）。進(jìn)一步研究中，使用NK細(xì)胞和T細(xì)胞缺陷的CD3ε小鼠替代NIH小鼠，成年小鼠中的致瘤率提高至75%，最低致瘤劑量降低至每只800 pg[4-6]。但截至目前尚沒(méi)有使用單一的HRAS表達(dá)質(zhì)粒在小鼠體內(nèi)試驗(yàn)中誘發(fā)腫瘤的報(bào)道。本研究嘗試使用含有G12C、G13C、Q61R和G12C/G13C/Q61R突變的HRAS（V112A）表達(dá)質(zhì)粒通過(guò)皮內(nèi)注射在NIH小鼠體內(nèi)誘發(fā)腫瘤。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株、動(dòng)物和主要材料

人結(jié)腸癌DiFi細(xì)胞和L929小鼠成纖維瘤細(xì)胞由中國(guó)食品藥品檢定研究院細(xì)胞室提供；SPF級(jí)NIH小鼠由中國(guó)食品藥品檢定研究院試驗(yàn)動(dòng)物繁育中心提供；HRAS基因由DiFi細(xì)胞中擴(kuò)增，經(jīng)測(cè)序，其含有V112A突變，將其命名為HRAS（V112A）；pCDNA3.1（+）質(zhì)粒由本室保存；鼠抗人HRAS抗體和鼠抗GAPDH抗體購(gòu)自中杉金橋公司；引物（表1）由上海生物工程技術(shù)有限公司合成；Trizol、Lipofectamine 2000和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Superscript First-Strand Synthesis System）購(gòu)自Invitrogen公司；pMD-18-T載體、2×Primer Start Premix購(gòu)自Takara公司；質(zhì)粒大提試劑盒購(gòu)自Gibco公司。

表1 研究中使用的引物

1.2 HRAS（V112A）的克隆

Trizol提取DiFi細(xì)胞總RNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，隨機(jī)引物逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以合成的cDNA為模板，以HRAS-NheⅠ-F+HRAS-R1引物和HRAS-F1+HRAS-Hin dⅢ-R引物分別擴(kuò)增HRAS（V112A）的1～440 nt片段和44～570 nt片段，切膠回收PCR產(chǎn)物并混合作為模板，以HRAS-NheⅠ-F和HRAS-Hin d Ⅲ-R 引物擴(kuò)增全長(zhǎng) HRAS（V112A）（570 bp）。NheⅠ和Hin d Ⅲ雙酶切PCR產(chǎn)物及pCDNA3.1（+）質(zhì)粒，4℃過(guò)夜連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑取重組質(zhì)粒測(cè)序，獲得pC-HRAS（V112A）重組質(zhì)粒。

1.3 HRAS（V112A）定點(diǎn)突變

按照文獻(xiàn)方法[7]，采用定點(diǎn)突變PCR方法，對(duì)HRAS（V112A）的12、13和61位密碼子分別進(jìn)行G12C、G13C和Q61R點(diǎn)突變及3個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合突變。簡(jiǎn)要描述如下：①配制50μL突變體系，含1μL pC-HRAS（V112A）、2 pmol混合突變引物（針對(duì)突變位點(diǎn)的正/反向突變引物，如：RM-G12C-F和RM-G12C-R各1 pmol混合）、25 μL 2×Primer Start Premix。②突變PCR。95℃變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃擴(kuò)增12 min，25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。③模板質(zhì)粒降解，PCR產(chǎn)物中加入1μL Dpn I酶37℃消化過(guò)夜。④突變質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α，挑克隆測(cè)序，根據(jù)測(cè)序結(jié)果選取在目的位置含有設(shè)計(jì)突變的克隆，根據(jù)突變類(lèi)型，將質(zhì)粒分別命名為 pC-HRAS（V112A/G12C）、 pC-HRAS（V112A/G13C）、pC-HRAS（V112A/Q61R）和 pC-HRAS（V112A/G12C/G13C/Q61R）。

1.4 Western blot檢測(cè)HRAS（V112A）及其突變體表達(dá)

按照說(shuō)明書(shū)操作，各質(zhì)粒使用Lipofectamine 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染6孔板中的L929細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48 h刮取細(xì)胞并使用預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞2遍后重懸于0.25 mL PBS中。細(xì)胞懸液中加入1/5體積6×SDS加樣緩沖液煮沸5 min，13 000 r/min離心10 min，取上清10%SDSPAGE電泳后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，以抗GAPDH抗體檢測(cè)GAPDH為內(nèi)對(duì)照，抗人HRAS抗體檢測(cè)HRAS（V112A）的表達(dá)；腫瘤組織中HRAS蛋白表達(dá)的Western blot檢測(cè)中，按照文獻(xiàn)方法進(jìn)行樣品處理[8]，用剪刀取1 g病變組織剪碎至乳糜狀，置于1 mL PBS中煮沸5 min，13 000 r/min離心10 min，取上清用于Western blot檢測(cè)。

1.5 質(zhì)料提取及小鼠體內(nèi)接種、觀察及分析

按質(zhì)粒大提試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取含HRAS（V112A）及點(diǎn)突變的質(zhì)粒，溶解于生理鹽水，紫外分光光度法測(cè)定濃度，根據(jù)檢測(cè)結(jié)果質(zhì)粒濃度調(diào)整至2 mg/mL。取6～8周齡雌性NIH小鼠，每組8只，分別于左側(cè)腋下按每只100μg（50μL）皮內(nèi)注射pC-HRAS（V112A）[HRAS（V112A）組]、pC-HRAS（V112A/G12C）[HRAS（V112A/G12C）組]、pC-HRAS（V112A/G13C）[HRAS（V112A/G13C）組]、pC-HRAS（V112A/Q61R）[HRAS（V112A/Q61R）組]、 pC-HRAS（V112A/G12C/G13C/Q61R）[HRAS（V112A/G12C/G13C/Q61R）組]和生理鹽水（對(duì)照組）。注射后于正常條件下飼養(yǎng)，定期觀察注射部位及全身病變情況。

1.6 病變組織中HRAS基因的PCR檢測(cè)

病變組織中DNA的分離采用文獻(xiàn)中的煮沸法[9-10]，簡(jiǎn)要描述如下，質(zhì)粒注射后4個(gè)月，取1 g病變組織剪刀剪碎至乳糜狀，置1 mL PBS中煮沸5 min，13 000 r/min離心10 min，取1μL上清作為模板，使用HRAS-NheⅠ-F和HRAS-R1引物擴(kuò)增HRAS 1～440 nt片段，切膠回收后連接pMD-18T載體測(cè)序。

2 結(jié)果

2.1 HRAS（V112A）的克隆和突變

以DiFi細(xì)胞cDNA為模板，PCR擴(kuò)增HRAS，將擴(kuò)增產(chǎn)物插入真核表達(dá)質(zhì)粒pCDNA3.1（+）并測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與人 HRAS 基因（Access Number：AB451336）比對(duì)，擴(kuò)增的HRAS在335 nt位發(fā)生G-C突變，導(dǎo)致其112位的Val突變?yōu)锳la（V112A）。為排除聚合酶錯(cuò)配導(dǎo)致的突變，再次擴(kuò)增，該突變?nèi)匀淮嬖?，將含有V112A 突 變 的 HRAS 基 因 命 名 為 HRAS（V112A）。以HRAS（V112A）為模板，使用Site-directed PCR突變[7]方法對(duì)設(shè)計(jì)位點(diǎn)進(jìn)行突變，測(cè)序結(jié)果表明各HRAS（V112A）突變體均在設(shè)計(jì)位置含有預(yù)期突變，Blast及測(cè)序比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖1。

2.2 重組質(zhì)粒在L929細(xì)胞中的表達(dá)

以pCDNA3.1（+）空質(zhì)粒作為對(duì)照，含HRAS（V112A）及其突變體的重組pCDNA3.1（+）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48 h后收取細(xì)胞進(jìn)行Western blot檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖2A。本研究Western blot檢測(cè)使用抗HRAS抗體購(gòu)自中杉金橋公司，為OriGene產(chǎn)品，雖然抗體所用的免疫原為全長(zhǎng)重組人HRAS蛋白，但該抗體與小鼠HRAS蛋白有交叉反應(yīng)，因此對(duì)照細(xì)胞（泳道1）21 kD位置有較弱的陽(yáng)性顯色條帶，但顯色強(qiáng)度顯著弱于質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。pC-HRAS（V112A）、pC-HRAS（V112A/G12C）、pC-HRAS（V112A/G13C）、pC-HRAS（V112A/Q61R）和 HRAS（V112A/G12C/G13C/Q61R）轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，21 kD位置均有HRAS強(qiáng)顯色條帶。Western blot檢測(cè)中HRAS均顯示為2～3條帶，且G12C突變HRAS的電泳遷移速率慢于野生型，而Q61R突變HRAS的遷移速率快于野生型，該現(xiàn)象與文獻(xiàn)[11-12]的報(bào)道結(jié)果相同，證明本研究中的重組質(zhì)粒能夠在細(xì)胞內(nèi)正確表達(dá)HRAS（V112A）及其各突變體。目前尚未見(jiàn)報(bào)道Gly13突變HRAS的電泳遷移速率變化情況，本研究中，G13C突變同G12C突變的HRAS（V112A）的遷移速率相近，均慢于HRAS（V112A）。HRAS（V112A/G12C/G13C/Q61R）的遷移速率慢于 HRAS（V112A/Q61R），但快于 HRAS（V112A）、HRAS（V112A/G12C）和HRAS（V112A/G13C）。

圖1 HRAS（V112A）的Blast結(jié)果及各突變體測(cè)序結(jié)果

2.3 小鼠體內(nèi)致瘤結(jié)果

各質(zhì)粒于腋下位置皮內(nèi)注射N(xiāo)IH小鼠后3個(gè)月，HRAS（V112A）組 和 HRAS（V112A/Q61R）組 分 別 有 4 只（50%）和1只（12.5%）小鼠于注射部位出現(xiàn)病變，小鼠噬咬導(dǎo)致脫毛和皮損（圖 3A），HRAS（V112A/G12C）組、HRAS（V112A/G13C）組和 HRAS（V112A/G12C/G13C/Q61R）組小鼠均未出現(xiàn)明顯病變。HRAS（V112A）組中，4只小鼠注射部位皮膚變厚呈增生樣改變，皮膚表面出現(xiàn)麥粒大小疣狀物，取1只小鼠處死后剪取病變皮膚測(cè)量，增生物體積約0.8 cm×0.4 cm×0.3 cm，外有包膜包裹，無(wú)明顯新生血管穿透包膜（圖3B）。剩余3只出現(xiàn)增生樣改變的小鼠在注射后5個(gè)月，病變自行消退。HRAS（V112A/Q61R）組中，1只小鼠在注射后4個(gè)月于注射部位生成腫瘤，體積約4.8 cm×2.2 cm×1.8 cm（圖3C），解剖后可見(jiàn)腫瘤外有包膜包裹，新生血管穿過(guò)包膜進(jìn)入腫瘤內(nèi)部（圖3D），腫瘤中心部位呈糜樣壞死，壞死部分約占腫瘤體積1/3。制備切片后進(jìn)行病理學(xué)檢查可見(jiàn)，核漿比增大，細(xì)胞核大小形態(tài)及染色深淺不一（圖4），表現(xiàn)為惡性腫瘤樣病理改變。小鼠體內(nèi)致瘤試驗(yàn)證明，每只小鼠單獨(dú)皮內(nèi)注射100μg的pC-HRAS（V112A/Q61R）質(zhì)?？稍贜IH小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)形成腫瘤。

圖2 Western blot檢測(cè)HRAS（V112A）及突變體在L929細(xì)胞中的表達(dá)

2.4 病變組織中HRAS基因的表達(dá)和測(cè)序

采用PCR和Western blot方法檢測(cè)HRAS（V112A）組和HRAS（V112A/Q61R）組小鼠病變組織中HRAS核酸序列和蛋白表達(dá)情況。PCR可在病變組織中擴(kuò)增出陽(yáng)性條帶，回收擴(kuò)增產(chǎn)物連接T載體測(cè)序，HRAS（V112A）組和HRAS（V112A/Q61R）組分別挑取10個(gè)和3個(gè)重組克隆送測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，擴(kuò)增產(chǎn)物的核苷酸序列均與各組注射的HRAS基因序列對(duì)應(yīng)（比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖5）。通過(guò)比對(duì)可以發(fā)現(xiàn)，HRAS（V112A）組增生樣組織和HRAS（V112A/Q61R）組腫瘤組織中擴(kuò)增的HRAS序列均含有V112A突變，10個(gè)HRAS（V112A）組HRAS擴(kuò)增序列中均不含G12C、G13C和Q61R突變，而3個(gè)HRAS（V112A/Q61R）組HRAS擴(kuò)增序列中僅含有Q61R突變。值得注意的是，40%的HRAS（V112A）組HRAS序列和33%的HRAS（V112A/Q61R）組HRAS序列中含有除設(shè)計(jì)位點(diǎn)以外的其他突變，該現(xiàn)象在腫瘤組織已有報(bào)道，可能為腫瘤組織中細(xì)胞微環(huán)境紊亂和異常增生導(dǎo)致的基因突變所致[13-14]。

Western blot檢測(cè)病變組織中HRAS的表達(dá)，分別取HRAS（V112A/Q61R）組小鼠腫瘤的實(shí)體、壞死組織、HRAS（V112A）組小鼠增生樣病變組織進(jìn)行Western blot檢測(cè)，上述組織泳道中21 kD位置均有明顯HRAS顯色條帶，而對(duì)照組小鼠皮膚泳道中HRAS條帶顯色強(qiáng)度顯著弱于上述組織（圖6）。Western blot檢測(cè)的結(jié)果可 見(jiàn) ， HRAS（V112A/Q61R）仍 然 顯 示 出 較 HRAS（V112A）更快的遷移速率，說(shuō)明腫瘤組織中的HRAS基因在61位氨基酸位置存在突變。結(jié)合PCR和Western blot結(jié)果，可以認(rèn)定HRAS（V112A/Q61R）組中腫瘤發(fā)生與注射pC-HRAS（V112A/Q61R）質(zhì)粒相關(guān)。

圖3 HRAS（V112A）組及HRAS（V112A/Q61R）組小鼠病變

圖4 pC-HRAS（V112A/Q61R）誘發(fā)腫瘤的病理學(xué)檢查結(jié)果

圖5 小鼠腫瘤中擴(kuò)增HRAS的測(cè)序結(jié)果

3 討論

RAS基因（包括KRAS、NRAS和HRAS）的突變與腫瘤有密切的關(guān)系，在約15%的人類(lèi)腫瘤中，可檢測(cè)到RAS基因的突變，特別是在胰腺癌、結(jié)直腸癌和肺癌中，突變RAS的檢出率分別可達(dá)90%、50%和30%。常見(jiàn)的RAS基因突變位點(diǎn)為12和13位密碼子，占比約80%和17%，61位密碼子突變占比不足4%，在每個(gè)突變位點(diǎn)又存在多種突變形式[2]。本研究中，根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道選取G12C、G13C、Q61R以及3個(gè)位點(diǎn)聯(lián)合突變的HRAS（V112A）作研究對(duì)象，分析不同突變體能否在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤[15]。本研究中，從人結(jié)腸癌細(xì)胞系DiFi中擴(kuò)增HRAS含有V112A突變，該突變?cè)谥暗奈墨I(xiàn)報(bào)道中從未出現(xiàn)，但也有文獻(xiàn)報(bào)道除常見(jiàn)的12、13、61位氨基酸突變外，HRAS可含有其他與癌癥相關(guān)的罕見(jiàn)突變類(lèi)型，如 12（G）11 等[16]。Crowder等[17]在人多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞系OPM-2中檢測(cè)到K117V突變，該突變位點(diǎn)位于HRAS蛋白的GTP結(jié)合位點(diǎn)附近，展現(xiàn)出比G12V突變更強(qiáng)的轉(zhuǎn)化活性。與之前使用單獨(dú)的T24-HRAS不能在小鼠體內(nèi)誘發(fā)腫瘤的結(jié)果不同，本研究中，單獨(dú)HRAS（V112A/Q61R）的表達(dá)即可在NIH小鼠中誘發(fā)腫瘤的發(fā)生，該結(jié)果可能部分歸因于V112A突變賦予HRAS更強(qiáng)的致瘤活性。

HRAS的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能由兩個(gè)蛋白進(jìn)行調(diào)節(jié)：鳥(niǎo)苷酸轉(zhuǎn)化因子（guanine nucleotide exchange factors，GEFs）促進(jìn)HRAS與GDP的解離并與GTP結(jié)合，啟動(dòng)HRAS介導(dǎo)的激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；而GTP酶激活蛋白（GTPase-activating proteins，GAPs）則可激活 HRAS 的GTP酶活性，將GTP降解為GDP，關(guān)閉信號(hào)傳導(dǎo)。若HRAS突變后使其GTP酶活性降低，則可延長(zhǎng)激活信號(hào)的持續(xù)時(shí)間，增強(qiáng)細(xì)胞增殖能力，從而誘發(fā)腫瘤。HRAS蛋白的GTP酶活性依賴(lài)于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域：位于1～86 AA的SwitchⅡ結(jié)構(gòu)域和位于87～171 AA的Helix 3結(jié)構(gòu)域[18]（圖7）。GAP的精氨酸手指可借助電荷作用伸入HRAS的內(nèi)部與SwitchⅡ結(jié)合，提供正電荷穩(wěn)定GTP水解過(guò)程中產(chǎn)生的負(fù)電荷，增強(qiáng)HRAS的GTP酶活性[19]。若HRAS第12位氨基酸由比移值（Rate of flow，Rf）為0.30/0.06的疏水性較弱的Gly突變?yōu)槭杷暂^強(qiáng)的氨基酸，如：Ile（Rf=0.79/0.57）、Val（Rf=0.67/0.32）和 Leu（Rf=0.77/0.52），可影響 HRAS 與 GAP 的結(jié)合，降低HRAS的GTP酶活性，延長(zhǎng)激活信號(hào)的作用時(shí)間，促進(jìn)細(xì)胞增殖；如果突變?yōu)槭杷暂^弱的Pro（Rf=0.48/0.16）或極性氨基酸，則不會(huì)影響/增強(qiáng)HRAS與GAP結(jié)合，不影響/增強(qiáng)HRAS的GTP酶活性[20-23]，縮短激活信號(hào)的作用時(shí)間，抑制細(xì)胞增殖。當(dāng)前關(guān)于G13突變的文獻(xiàn)報(bào)道較少，但結(jié)構(gòu)研究表明G13也位于HRAS的GTP酶活性結(jié)構(gòu)域，因此可以推測(cè)G13突變對(duì)HRAS GTP酶活性的影響與G12相同[24]。根據(jù)上述分析，本研究中采用的G12C和G13C突變均為使用極性更強(qiáng)的非水解的極性氨基酸Cys（Rf=0.08/0.02）替代弱極性的Gly，增強(qiáng)HRAS與GAP的結(jié)合，從而會(huì)增強(qiáng)HRAS的GTP酶活性，因此G12C和G13C突變可能反而降低了HRAS（V112A）的致瘤活性。根據(jù)上述討論，也就可以理解在HRAS（V112A）組出現(xiàn)增生樣病變的情況下，HRAS（V112A/G12C）、HRAS（V112A/G13C）和含有上述兩個(gè)突變的HRAS（V112A/G12C/G13C/Q61R）組小鼠中均未出現(xiàn)明顯病變。HRAS蛋白通過(guò)61位Gln的氨基基團(tuán)形成氫鍵與GAP的精氨酸指結(jié)構(gòu)作用[25-26]，使用Arg替代Gln后，產(chǎn)生靜電斥力，降低HRAS與GAP的相互作用，降低HRAS的GTP酶活性，因此HRAS（V112A/Q61R）展現(xiàn)出更強(qiáng)的致瘤能力。

圖6 Western blot檢測(cè)HRAS（V112A）及突變體在NIH小鼠病變組織中的表達(dá)

圖7 HRAS蛋白3D結(jié)構(gòu)示意圖[18]

之前文獻(xiàn)報(bào)道中，使用分別表達(dá)T24-HRAS和cMYC的質(zhì)?；旌虾笞⑸涞姆绞?，每只小鼠注射劑量為12.5μg時(shí)，成年和新生小鼠中的致瘤率分別為20%和82%，但單獨(dú)使用的T24-HRAS表達(dá)質(zhì)粒未能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤形成[4-5]。本研究中，當(dāng)每只注射劑量為100 μg時(shí)，pC-HRAS（V112A/Q61R）在成年NIH小鼠中的的致瘤率為12.5%，該致瘤率雖然低于國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道，但首次在單獨(dú)使用HRAS表達(dá)質(zhì)粒的條件下，在NIH小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)腫瘤形成。