依托咪酯對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)電流-電壓曲線的離子通道機(jī)制研究

于嬋娟， 劉亞華， 田 亮， 黃春陽(yáng)， 劉 濤， 蔣 暉

(新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院麻醉科， 烏魯木齊 830011)

神經(jīng)元突觸前膜所釋放的神經(jīng)遞質(zhì)和處于突觸后膜上的相應(yīng)受體接觸所產(chǎn)生的突觸后效應(yīng)多種多樣，其中最重要的效應(yīng)之一是直接作用于突觸后膜配體門控離子通道產(chǎn)生突觸后電位。根據(jù)突觸后膜離子通道開(kāi)放離子轉(zhuǎn)運(yùn)的影響，突觸后電位分為興奮性突觸后電位(excitatory postsynaptic potential， EPSP),即神經(jīng)遞質(zhì)引起短暫的突觸后膜去極化，使神經(jīng)元靜息電位改變產(chǎn)生興奮；抑制性突觸后電位(inhibitory postsynaptic potential ，IPSP),神經(jīng)遞質(zhì)引起短暫的突觸后膜超極化，使神經(jīng)元興奮性遭到抑制。 其中處于突觸后膜上的GABAA受體為神經(jīng)元主要的抑制性膜蛋白受體，該受體是一種配體門控的氯離子通道，由5個(gè)亞基組成。神經(jīng)元(GABA)受體介導(dǎo)的抑制突觸傳遞的作用增強(qiáng)，其主要機(jī)制是許多全身麻醉用藥和GABAA受體相互作用直接或間接導(dǎo)致了氯離子內(nèi)流的結(jié)果[1-2]。

依托咪酯(etomidate，ETO)是一種靜脈注射麻醉劑，因?yàn)槠鹦Э?，恢?fù)快，對(duì)心血管和呼吸系統(tǒng)沒(méi)有明顯的毒副作用，通常用于臨床麻醉誘導(dǎo)或者短小手術(shù)的麻醉。有研究表明，依托咪酯主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的GABAA受體，其不僅能增強(qiáng)γ-氨基丁酸(GABA)和GABAA受體結(jié)合所產(chǎn)生的效應(yīng)，也可以直接作用于GABAA受體發(fā)揮類γ-氨基丁酸樣作用[3]。依托咪酯的麻醉作用主要是與γ-氨基丁酸(GABA)受體結(jié)合，使膜氯離子通道開(kāi)放，氯離子內(nèi)流使細(xì)胞膜超極化，從而抑制細(xì)胞的興奮性。

本研究應(yīng)用全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)，分析依托咪酯對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents，EPSCs)的電流-電壓(I-V)曲線的影響以及與外向整流單通道氯電流的關(guān)系，進(jìn)一步揭示依托咪酯通過(guò)作用于GABA受體所產(chǎn)生的突觸后電流的細(xì)胞學(xué)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1腦片的制備選取生長(zhǎng)13～19 d的Wistar大鼠20只，雄性,空調(diào)室內(nèi)飼養(yǎng)，控制室溫為22～25℃，濕度為40%～60%，自由進(jìn)水進(jìn)食。將大鼠迅速斷頭，使用外科器械去除顱骨，分離腦組織，切取海馬半球，遂迅速將所切取的海馬半球置于切片機(jī)載物臺(tái)上，放入裝有0～4℃人工冰水腦脊液(以95%O2/5%CO2飽和)的切片凹槽中。使用振動(dòng)切片機(jī)切取400 μm厚的海馬腦部切片，后將其放置于37℃孵化槽中培養(yǎng)1 h，取出在室溫下培養(yǎng)1 h(孵化槽中仍灌注以95%O2/5%CO2飽和的人工腦脊液)。

1.2藥品與試劑人工腦脊液(NaCl 118，KCl 4.75，KH2PO41.19，NaHCO325，MgSO41.19，D-glucose 11，CaCl2·2H2O 2.94，pH=7.4)；電極內(nèi)液(K-gluconate 170，HEPES 10，NaCl 10，MgCl22，EGTA 0.2，Mg-ATP 3.5，Na-GTP 1.0，pH=7.2),以上藥物濃度單位均為mmol/L。

依托咪酯脂肪乳(2 mg/mL,中國(guó)徐州恩藥業(yè)集團(tuán)有限公司有限公司，批號(hào)H20120511)。10%脂肪乳劑(樂(lè)山譽(yù)衡藥業(yè)公司，批號(hào)0020801)。

1.3電生理記錄所有實(shí)驗(yàn)均控制在室溫18～23℃下進(jìn)行。將所制備腦片移放到記錄槽中，通過(guò)水管道以95%O2/5%CO2飽和的人工腦脊液持續(xù)灌注，流速控制為2 mL/min左右，凹槽灌注溫度為30～32℃，循環(huán)液體容積為50 mL。利用拉制儀將硅硼玻璃管拉制成實(shí)驗(yàn)用記錄電極，電極電阻為3.5～5 MΩ。隔離器連接雙極電刺激Schaeffer 側(cè)支/聯(lián)合纖維(刺激沖動(dòng)性為0.1 ms)，間隔為20 s; 記錄CA1區(qū)錐體神經(jīng)元細(xì)胞EPSC。刺激強(qiáng)度最大為50%為宜，保持膜鉗制電位為-70 mV。

全細(xì)胞記錄使用Axopatch 200B膜片鉗放大器，電刺激脈沖和信號(hào)采集以及單通道氯電流頻譜記錄均由計(jì)算機(jī)程序Clampx9.0及digidata1320A接口完成。采樣頻率為10 KHz，Bessel低通濾波器的頻率設(shè)定為2 KHz。連續(xù)監(jiān)測(cè)接觸電阻(access resistance，Ra)，只分析Ra穩(wěn)定的細(xì)胞。采集數(shù)據(jù)使用pClamp 8.0軟件進(jìn)行整合分析，整合通道開(kāi)放概率(P)通過(guò)公式NP=∑{t1+t2+t3…+tn}(n=10)進(jìn)行處理，其中t為各樣本通道開(kāi)放增強(qiáng)時(shí)間占總刺激時(shí)間的比例。

1.4實(shí)驗(yàn)分組將20張制備的大腦切片(n=20)分為60 μL脂肪乳劑組(n=10)和10 μmol/L依托咪酯組(n=10)。 使用60 μL脂肪乳劑以及依托咪酯10 μmol/ L分組培養(yǎng)大腦切片40 min[4]，觀察待基線穩(wěn)定后，Schaeffer 側(cè)支/聯(lián)合纖維給予單一刺激，同時(shí)改變CA1區(qū)錐體神經(jīng)元膜鉗制電位(-100 mV～ +40 mV，幅度為20 mV)，每個(gè)分段鉗制電壓給予1次電刺激，實(shí)時(shí)記錄單通道氯離子整合電流通道開(kāi)放強(qiáng)度，繪制電壓-電流(I-V)曲線。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用Clamfit9.0和Origin5.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。EPSC頻率值做標(biāo)準(zhǔn)化處理，即檢測(cè)數(shù)據(jù)以相對(duì)于每組基線均值的比值或百分率表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(-x±s)。組內(nèi)比較采用配對(duì)t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1依托咪酯對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)的I-V曲線的影響10 μmol/L依托咪酯組和60 μL脂肪乳劑組根據(jù)膜鉗制電壓測(cè)得的相對(duì)化EPSC數(shù)值見(jiàn)表1。隨著膜鉗制電位的變化，10 μmol/L依托咪酯組的相對(duì)EPSC值在-60、-40、-20、0、20及40 mV均高于60 μL脂肪乳劑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 10 μmol/L依托咪酯及60 μL脂肪乳劑對(duì)相對(duì)EPSC的影響(-x±s， mV)

注：與60 μL脂肪乳劑組相比較，P<0.05。

根據(jù)該表制圖后形成圖1，改變膜鉗制電壓(-100～+40 mV)，發(fā)現(xiàn)脂肪乳劑組反轉(zhuǎn)電位為-53 mV左右，10 μmol/L依托咪酯組為-60 mV左右，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。說(shuō)明10 μmol/L依托咪酯降低反轉(zhuǎn)電位，使I-V曲線左移。

全程實(shí)時(shí)記錄外向整流單通道氯電流通道的開(kāi)放概率，脂肪乳劑組膜鉗制電壓(-100～+40 mV)時(shí)通道開(kāi)放NP頻譜見(jiàn)圖2；依托咪酯組膜鉗制電壓(-100～+40 mV)時(shí)通道開(kāi)放NP頻譜見(jiàn)圖3。與脂肪乳劑組比較，依托咪酯組在各個(gè)膜鉗制電壓檢測(cè)點(diǎn)氯離子通道開(kāi)放概率更頻繁。

3討論

GABA神經(jīng)元在大腦的海馬結(jié)構(gòu)中分布非常廣泛，其釋放的抑制性氨基酸GABA具有極其重要的生理作用，特別在錐體細(xì)胞、海馬中間神經(jīng)元之間建立的快突觸傳導(dǎo)通路以及中隔與海馬中間神經(jīng)元的GABA能神經(jīng)傳導(dǎo)通路中，GABA均是其突觸連接間最為主要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)。 而GABAA受體是一種神經(jīng)遞質(zhì)門控的氯離子通道，是由5個(gè)亞基組成的膜蛋白受體，不同的亞基又包含不同的亞型，主要有6類α亞基(α1～α6 )、4類β亞基(β1～β4)、4類γ亞基(γ1～γ4)及δ、ε、θ和П亞基等。均是由5個(gè)亞基包圍分子中心區(qū)域形成一個(gè)由神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸門控性的氯離子通道[5-6]。

配體門控離子通道是一類與相應(yīng)受體偶聯(lián)于同一跨膜蛋白大分子上的通道，受體未與遞質(zhì)結(jié)合時(shí)，該通道呈關(guān)閉狀態(tài)，突觸后膜保持靜息電位[7-9]。一旦神經(jīng)遞質(zhì)與相應(yīng)受體結(jié)合使后者激活時(shí)，受體蛋白分子結(jié)構(gòu)變構(gòu)，離子通道打開(kāi)形成貫通細(xì)胞膜的雙向離子通道，離子出現(xiàn)跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，其順膜電化學(xué)梯度出現(xiàn)的轉(zhuǎn)運(yùn)形成打破靜息電位的膜電位差，形成動(dòng)作電流，進(jìn)而形成動(dòng)作電位。當(dāng)以上作用于突觸結(jié)構(gòu)時(shí)，通過(guò)已打開(kāi)的突觸后膜的配體門控離子通道所產(chǎn)生的電流，集成為突觸后電流。其膜內(nèi)外形成的總電位差稱為突觸后電位。突觸后電流類型可按照其最終形成的突觸后電位分為興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic current，EPSC)和抑制性突觸后電流(inhibitory postsynaptic current，IPSC)。正常情況下，突觸前膜釋放的興奮性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸和突觸后膜的AMPA和NMDA受體結(jié)合產(chǎn)生內(nèi)向的陽(yáng)離子電流(即EPSC)，其主要開(kāi)放Na+離子通道和Ca2+離子通道。而GABAA受體屬于配體門控的陰離子通道，主要與抑制性氨基酸神經(jīng)遞質(zhì)γ-氨基丁酸結(jié)合，對(duì)Cl-通透，發(fā)生Cl-內(nèi)流，從而使突觸后膜超級(jí)化對(duì)神經(jīng)元信號(hào)傳導(dǎo)產(chǎn)生抑制性的作用。

本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步分析10 μmol/L依托咪酯對(duì)EPSC的電流-電壓曲線的影響，發(fā)現(xiàn)依托咪酯可使I-V曲線左移，使反轉(zhuǎn)電位由-53 mV降低為-60 mV左右，說(shuō)明了參與構(gòu)成EPSC的離子發(fā)生了變化，其中外向的電流有所增加。通過(guò)數(shù)據(jù)處理整合單通道氯電流的開(kāi)放NP頻譜圖可以得知在這一時(shí)刻氯的外向電流明顯增強(qiáng)，氯通道的開(kāi)放程度加大，故進(jìn)一步闡述了所增加的外向電流主要是由氯離子的跨膜內(nèi)流轉(zhuǎn)運(yùn)引起的。

正常情況下，氯離子對(duì)靜息膜電位的貢獻(xiàn)很小，而胞內(nèi)外氯離子濃度為細(xì)胞膜電位所調(diào)節(jié)并受到膜上存在的任何氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)機(jī)制的調(diào)節(jié)。氯離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)，產(chǎn)生的電位結(jié)果可能是超極化的，也可以是去極化的，這種效應(yīng)依賴于氯離子的平衡電位相對(duì)于靜息電位為負(fù)或?yàn)檎?，而其又取決于細(xì)胞內(nèi)氯離子轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)所起的作用是消耗還是聚集。在靜息電位去極化作用越是明顯的細(xì)胞中，麻醉藥物引起的超極化作用也就越大，這與麻醉藥物引起的K+和Cl-跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)作用非常一致，這些離子轉(zhuǎn)運(yùn)出現(xiàn)的電位變化結(jié)果與細(xì)胞的靜息電位狀態(tài)十分相近，其結(jié)果可能更好地解釋了其超極化機(jī)制與細(xì)胞復(fù)極化之間的相似關(guān)系。同時(shí)，全身麻醉類藥物降低海馬神經(jīng)元的膜電阻，增加氯離子通道的開(kāi)放率，使海馬神經(jīng)元氯離子內(nèi)向轉(zhuǎn)運(yùn)顯著增強(qiáng)，細(xì)胞膜電位差進(jìn)一步加大。因此，本研究結(jié)果提示，依托咪酯作用于神經(jīng)元突觸結(jié)構(gòu)，與膜上GABAA受體結(jié)合，直接或間接改變了構(gòu)成EPSCs的離子成分，使外向電流增加，且該外向電流很可能主要為氯離子的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)所形成。

參考文獻(xiàn)：

[1] Bruce E, Herring M, Carolyn P,et al. Etomidate and propofol inhibit the neurotransmitter release machinery at different sites[J].Physiology，2011,589(5):1103-1115.

[2] Christian G, Rachel J, Uwe R, et al. Modulation of presynaptic β3-containing GABAAreceptors limits the immobilizing actions of GABA ergic anesthetics[J]. Mol Pharmacol， 2007,72(8):780-787.

[3] Erwin H，Jacob Engelmann,Kirsty G,et al.Etomidate Reduces initiation of backpropagating dendritic action potentials:Implications for sensory processing and synaptic plasticity during anesthesia[J]. Neurophysiology， 2007,97(2):2373-2384.

[4] 于嬋娟,劉濤,蔣暉，等.依托咪酯對(duì)大鼠海馬CA1區(qū)興奮性突觸后電流的影響[J].江蘇醫(yī)藥,2012,20(37):1023-1025.

[5] 李建國(guó),李曉明，胡平，等.成年大鼠海馬ca1區(qū)錐體神經(jīng)元外向整流氯離子單通道特性[J].生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展,2003,30(6):874-878.

[6] 陳瑛,蘇瑞斌.氯離子通道和藥物靶標(biāo)[J].國(guó)際藥學(xué)研究雜志,2009,36(6):457-460.

[7] 孫雪華,林群,曾邦雄.依托咪酯易化大鼠海馬CA1區(qū)長(zhǎng)時(shí)程抑制的誘導(dǎo)[J].福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2005,39(2):133-136.

[8] 王浩森.氯離子通道生理藥理學(xué)特點(diǎn)及相關(guān)疾病的研究進(jìn)展[J].臨床與醫(yī)療,2012,11:489-491

[9] 謝玉波,施小彤,劉敬臣.異丙酚或依托咪酯對(duì)戊四唑誘發(fā)大鼠海馬CAl區(qū)神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢缓屯挥|傳遞的影響[J].中華麻醉學(xué)雜志,2007,27(7):591-593.