新疆維吾爾族婦女宮頸癌中P53、IGF-I、VEGF和Bcl-2、Bax的表達及臨床意義

韓娜娜， 金 華， 馬翔宇， 劉 艷， 張 潔

(1新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦科, 烏魯木齊 830011; 2中山大學藥學院， 廣州 510006)

新疆地區(qū)宮頸癌的發(fā)病率及病死率一直居全國之首，近年來有逐漸年輕化趨勢。新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院10 a病案統(tǒng)計顯示，收治的各類惡性腫瘤中宮頸癌占18.9%，位居第1位。每年新收治的子宮頸癌約500例，其中維吾爾族婦女占70%～80%，特別是南疆維吾爾族婦女宮頸癌患病人數在全國少數民族中占第1位[1]。這種民族聚集性高發(fā)的現象提示，除環(huán)境致癌因素外，可能還存在遺傳易感性，因此有必要了解新疆維吾爾族婦女宮頸癌中與發(fā)病相關的細胞分化、增殖及凋亡相關調節(jié)蛋白的表達情況。近年來研究發(fā)現，P53、胰島素樣生長因子-I (insulin like growth factors，IGF-I)、血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、 Bcl-2和Bax與腫瘤的侵襲、轉移和預后不良密切相關[2]。本研究選取新疆宮頸癌高發(fā)人群維吾爾族婦女宮頸病變樣本資源，在mRNA和蛋白表達水平對P53、IGF-I、VEGF及凋亡相關因子Bcl-2和Bax在宮頸癌中的表達、分布為切入點，探討新疆維吾爾族婦女宮頸癌的高發(fā)機制，并試圖為本地區(qū)宮頸癌的早期診斷、判斷預后尋找有效的生物學指標。

1 材料與方法

1.1研究對象選取2012年10月-2013年6月新疆醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院婦科收治的維吾爾族婦女浸潤性宮頸癌(Invasive Cervical Cancer，ICC)組織38例作為宮頸癌組，以同期新疆維吾爾族婦女良性病變行子宮切除患者正?；蛘呗詫m頸炎組織32例作為正常對照組。年齡27～58 歲，中位年齡(48.32±7.65)歲。納入病例時排除已接受過腫瘤手術切除或放化療的患者，同時排除患有子宮切除或骨盆放射治療史、其他惡性腫瘤以及呼吸系統(tǒng)、心血管和代謝性疾病等其他嚴重疾病的患者。所有組織標本均經病理學確診，并且患者均簽署知情同意書。

1.2主要試劑及儀器Trizol 試劑(美國 Invitrogen公司)，熒光定量 PCR 試劑盒、dNTPs 及逆轉錄酶 (北京康潤生物公司)，ABI Prism 7500 熒光定量 PCR 儀(美國 ABI 公司)。P53、IGF-I、VEGF、Bcl-2和Bax特異性單克隆抗體(Santa Cruz 和Anbobio公司)，酶標二抗和DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術公司)。

1.3實時熒光定量PCR(RTFQ-PCR)檢測

1.3.1 引物設計合成 由NCBI基因庫獲知人類表皮生長因子受體-2(HER-2)、基質金屬蛋白酶-2(MMP-2)、表皮細胞生長因子(EGF)、IGF-I、VEGF和內參照GAPDH基因的序列，按照原則設計和擴增6種基因的引物，引物由北京康潤生物合成。實時熒光定量PCR引物的序列見表1。

表1 引物設計序列

1.3.2 RNA提取、cDNA合成和熒光定量PCR反應 采用Trizol法提取RNA后逆轉錄合成cDNA，按照熒光定量PCR試劑盒說明書進行操作，反應體系: 擴增條件：94℃ 2 min熱變性后, 進行40個循環(huán)，94℃ 30 s, 55℃30 s, 72℃延伸(1 min/kb),72℃延伸7 min。熒光定量PCR儀擴增并采集數據，根據數據分別繪制2種樣品的標準曲線。

1.4蛋白免疫印跡選擇兩組在RTFQ-PCR結果中差異有統(tǒng)計學意義的基因，對其蛋白的表達含量進行測定。取宮頸組織0.5 g，剪碎加入細胞裂解液, 勻漿裂解40 min，12 000 r/min離心5 min，收集上清液進行蛋白定量 (BCA法)。取40 μg總蛋白進行12.5%變性SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳，電轉移，麗春紅S染色，封閉非特異性的結合位點，TBST洗膜，加入預測蛋白的一抗孵育1 h。TBST 洗膜后加入結合有辣根過氧化物酶標記的鼠抗兔的IgG 二抗孵育1 h，化學發(fā)光、顯影、定影，以GAPDH蛋白作為內參照。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計學分析，資料分析采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1熒光定量結果與正常對照組(mRNA表達數據為1)比較，宮頸癌組患者宮頸組織中IGF-I、VEGF 和Bcl-2表達均有不同程度的升高，P53、Bax表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。

2.2蛋白免疫印跡結果與正常對照組比較， 宮頸癌組患者宮頸組織中VEGF、Bcl-2表達均有不同程度的升高，P53、Bax表達降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，而兩組IGF-I蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義，見圖2、3。

2.3兩組Bcl-2/Bax值比較結果與正常對照組比較，在mRNA和蛋白質水平，宮頸癌組Bcl-2表達均明顯升高，而Bax表達均明顯下降，Bcl-2/Bax值顯著升高，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖4。

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是多種因素作用的結果，有內因也有外因，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中總要涉及細胞的增生分化、凋亡、細胞周期的調控、信號傳導以及腫瘤中血管的生成等，與很多細胞因子有關，有的參與細胞的增生分化；有的參與細胞周期的調控；有的與血管的生成有關，或者同時有多種功能并相互作用。

本研究選取與腫瘤生長、浸潤、轉移密切相關的P53、IGF-I、VEGF 和Bcl-2 、Bax 5個因子，檢測了其在維吾爾族婦女宮頸癌組織中的表達變化，從整體水平篩查與子宮頸癌發(fā)生相關的分子生物學指標，對維吾爾族宮頸癌的早期診斷及篩選治療靶點等具有重要的意義。

P53基因位于17號染色體，是重要的抑癌基因，分為野生型和突變型，野生型抗腫瘤的作用主要是阻止G1/G0期，使細胞不能進入S期，從而抑制細胞的增殖[3]。突變是人類腫瘤最常見的基因改變之一，在200多種不同的腫瘤中有50% 的腫瘤帶有P53 基因突變,P53 基因的缺乏還能導致早期大量腫瘤的發(fā)生。齊朝陽等[4]報道了P53 基因突變及P53 蛋白過量表達與宮頸癌預后的關系。在一定的條件下，P53 基因是“基因衛(wèi)士”，而在條件改變后，又可以轉化為“基因殺手”。也就是說，P53基因發(fā)生突變，可導致穩(wěn)定蛋白不能完成抑制細胞增殖的作用，促進惡性轉化，腫瘤侵襲性增強，使得P53基因由抑癌基因轉化為原癌基因，突變的P53失去抑制腫瘤細胞生長的功能，從而促進腫瘤的發(fā)生[4]。本研究使用熒光定量PCR(RTFQ-PCR)和蛋白免疫印跡(WB)技術檢測宮頸癌組織及正常宮頸組織中的P53在mRNA和蛋白表達水平，發(fā)現差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明P53基因突變在宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。

IGF-I調控腫瘤的可能途徑是抑制凋亡。細胞凋亡，又稱程序性細胞死亡(programmed cell death,PCD)，受各種凋亡基因的調控，包括內源性和外源性2種機制。IGF-Ⅰ是一類具有促進細胞增殖、分化以及血管形成等多種生物活性的多肽生長因子，其與多種腫瘤的惡性轉化和侵襲轉移有關[5]。 有研究顯示，IGF-I可以明顯提高腫瘤細胞中血管內皮生長因子( VEGF )的表達, 促進腫瘤血管的形成及腫瘤的生長、轉移； ICG-I在促進腫瘤新生血管形成和腫瘤生長轉移中起重要作用[6]，而阻斷這些環(huán)節(jié)有可能成為治療宮頸癌新的靶點之一。本研究表明,在mRNA表達水平，IGF-I在宮頸癌患者宮頸組織中表達升高，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。在蛋白水平表達中，兩組IGF-I表達比較差異無統(tǒng)計學意義。

VEGF是一種與血管內皮細胞特異性結合的肝素結合糖蛋白，是目前已知的作用最強的促血管形成因子之一，也是腫瘤細胞分泌的血管形成因子中最重要的一種[7]。其能促進腫瘤血管生成，增強微血管通透性，增加腫瘤細胞氧和營養(yǎng)物質的供給，并為腫瘤細胞脫落和基質擴散創(chuàng)造條件。 目前研究發(fā)現VEGF在腫瘤組織中高表達，不但促進腫瘤的血管形成，并且與宮頸癌等多種腫瘤的發(fā)生、轉移和預后密切相關[8]。本研究結果顯示，與正常對照組比較，VEGF在宮頸癌患者宮頸組織中表達升高，在mRNA和蛋白表達水平中差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，證實VEGF與宮頸癌關系密切。

Bcl-2是Bcl-2基因家族中的原癌基因之一，包括凋亡前體蛋白及生存前體蛋白成員，對內源性細胞死亡途徑至關重要，可以抑制腫瘤細胞的凋亡，與其他癌基因如P53等共同控制著細胞的生長、分化、增生和凋亡[9]。而Bax可與線粒體上的電壓依賴性離子通道相互作用，介導細胞色素C的釋放，誘導凋亡發(fā)生。本研究分別檢測了Bcl-2和Bax這2種凋亡關鍵因子，發(fā)現與正常對照組比較，在mRNA和蛋白水平，Bcl-2在宮頸癌組織中的表達均明顯升高，而Bax的表達均明顯下降，Bcl-2/Bax值顯著升高(P<0.05)。其在多種腫瘤細胞內呈高表達，而促凋亡因子Bax呈低表達。由于細胞死亡的易感性受控于胞質內Bcl-2和Bax間的平衡，Bcl-2/Bax比值增大使細胞凋亡過度抑制，導致腫瘤細胞以絕對的優(yōu)勢獲得生長，并對凋亡信號不再敏感，這種“一邊倒”的生長模式打破了正常細胞的凋亡機制，使得腫瘤細胞不斷發(fā)展、惡化[10]。

研究表明，惡性腫瘤的浸潤轉移是一個多步驟、漸進累積的復雜過程，在此過程中機體和細胞發(fā)生了許多重要改變，如細胞增殖、細胞外基質降解、腫瘤細胞黏附、細胞遷移、腫瘤血管形成等，它也是轉移中的腫瘤“分子進化”的過程[11]。隨著研究的深入，人們將揭示出P53、IGF-I、VEGF及凋亡相關因子Bcl-2和Bax在惡性腫瘤疾病發(fā)生發(fā)展過程中具體作用機制，探討其與宮頸癌的關系及可能存在的差異，對闡釋新疆維吾爾族婦女宮頸癌的早期診斷和治療提供有力的理論依據。本研究臨床例數尚少，其關系還需進一步的大量臨床研究加以佐證。

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