響應(yīng)面法優(yōu)化香菇液體發(fā)酵條件

張安寧　劉連成

摘要：在香菇液態(tài)發(fā)酵單因素試驗基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面法對發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化試驗，依據(jù)Box-Benhnken（BBD）設(shè)計預(yù)測發(fā)酵的最佳條件為：接種量12.42%、pH值4.96、培養(yǎng)溫度24.11 ℃。在轉(zhuǎn)速為160 r/min條件下按照最佳條件培養(yǎng)，菌絲生物量實測值為17.76 g/L，與理論值17.58 g/L相差1.02%。

關(guān)鍵詞：響應(yīng)面法；液態(tài)發(fā)酵；條件優(yōu)化；生物量

中圖分類號： TQ920.1 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號：1002-1302（2014）03-0200-04

香菇（Lentinula edodes）別稱香蕈、香菌等，分類上屬擔(dān)子菌門層菌綱傘菌目側(cè)耳科香菇屬[1]，是世界著名食用菌之一。它不僅肉質(zhì)肥厚脆嫩，香氣獨(dú)特，而且具有很高的藥用和保健價值[2-4]。我國是世界上香菇人工栽培最早的國家，也是最大的生產(chǎn)國。我國對香菇液態(tài)發(fā)酵工藝的研究雖有報道，但對其發(fā)酵條件的研究大多停留在單因素試驗方面[5-7]，很少研究香菇液態(tài)發(fā)酵過程中各因素之間的交互作用。響應(yīng)面法已被廣泛應(yīng)用于生物過程的優(yōu)化[8-9]，但在香菇液態(tài)發(fā)酵條件研究方面報道較少。前期研究利用意楊下腳料作為主要碳源培養(yǎng)獲得高產(chǎn)香菇菌種（香菇933），并研究出該香菇菌種液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)基的適宜配方，在此基礎(chǔ)上為進(jìn)一步提高香菇產(chǎn)量和質(zhì)量，本試驗利用響應(yīng)面法對其液態(tài)發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化，找出適合香菇菌絲生長的最佳培養(yǎng)條件，為香菇液體菌種培養(yǎng)和規(guī)模液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種 香菇933菌種，由江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院省級食品微生物工程實驗室篩選提供。

1.1.2 主要儀器 ZQZY-HB型全溫振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器公司生產(chǎn)；LDZ5-2型高速離心機(jī)，北京京立離心機(jī)有限公司生產(chǎn)，JY92-Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎儀，廈門精密儀器有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 培養(yǎng)基 （1）母種和活化培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g/L（煮汁）、瓊脂20 g/L、葡萄糖15 g/L、KH2PO4 3 g/L、MgSO4 1 g/L、KCl 0.5 g/L、pH值自然。（2）液體種子和發(fā)酵培養(yǎng)基：蔗糖20 g/L、酵母膏10 g/L、MgSO4 1 g/L、KH2PO4 3 g/L、KCl 0.5 g/L、初始pH值5～6。

1.2 方法

1.2.1 種子液的培養(yǎng) 取500 mL的三角瓶，加入100 mL液體種子培養(yǎng)基，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min，冷卻后接入蠶豆大活化后的斜面香菇菌種塊，在轉(zhuǎn)速為160 r/min的條件下24 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)5 d，得到帶有細(xì)密菌絲球的種子液。

1.2.2 菌絲體生物量的測定 將待測香菇菌絲發(fā)酵液放于離心機(jī)中，設(shè)定轉(zhuǎn)速為4 000 r/min，離心15 min，上清液用于多糖提取。用去離子水洗滌沉淀4次，置于60 ℃干燥至恒重，即得菌絲體生物量。

1.2.3 發(fā)酵液及香菇菌絲體總粗多糖的測定[10-11] 取上述發(fā)酵上清液加4倍體積95%乙醇，于4 ℃下靜置24 h，在 5 000 r/min 下離心15 min，沉淀用無水乙醇洗滌、低溫干燥，得到發(fā)酵液粗多糖。將上述“1.2.2”稱重后的香菇菌絲體超聲波粉碎，加入約20倍體積的蒸餾水，98 ℃抽提3 h，過濾并將濾液濃縮，用4倍體積95%乙醇靜置24 h，在5 000 r/min下離心15 min，去上清液，沉淀用無水乙醇洗2次，低溫干燥，即為香菇菌絲粗多糖。發(fā)酵液粗多糖和香菇菌絲粗多糖混合后稱重即得總粗多糖。

1.2.4 香菇液體發(fā)酵單因素試驗設(shè)計 （1）接種量處理：將裝有100 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基的 500 mL 三角瓶，經(jīng)121 ℃高壓蒸汽滅菌25 min，按不同接種量（體積比）將培養(yǎng)好的液體菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為160 r/min的條件下 24 ℃ 振蕩培養(yǎng)3 d，每處理做3次平行試驗，計算發(fā)酵液生物量和總粗多糖的平均值，下同。（2）pH值處理：用NaOH或HCl調(diào)節(jié)初始發(fā)酵液的pH值，設(shè)置不同的pH值，取100 mL裝入500 mL的三角瓶中，滅菌方法同（1），按12%（體積比）的接種量將培養(yǎng)好的液體菌種接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，在轉(zhuǎn)速為 160 r/min 的條件下24 ℃振蕩培養(yǎng)3 d。（3）溫度處理：按（1）的方法量取液體發(fā)酵培養(yǎng)基并滅菌，將液體菌種按12%（體積比）的接種量接種，設(shè)置不同溫度，在轉(zhuǎn)速160 r/min條件下恒溫培養(yǎng)3 d。（4）轉(zhuǎn)速的處理：按（1）的方法量取液體發(fā)酵培養(yǎng)基并滅菌，將液體菌種按12%（體積比）的接種量接種，設(shè)置不同轉(zhuǎn)速（r/min）進(jìn)行培養(yǎng)，24 ℃恒溫培養(yǎng)3 d。

1.2.5 香菇液態(tài)發(fā)酵工藝的優(yōu)化設(shè)計 選擇接種量、接種溫度、轉(zhuǎn)速3個因素對生物量和總多糖有顯著影響的因素進(jìn)行響應(yīng)面試驗設(shè)計，通過Design Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析，預(yù)測香菇液態(tài)發(fā)酵最優(yōu)工藝參數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種量對香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

接種量的大小與該菌在發(fā)酵液中生長繁殖的速度有關(guān)。接種量大，種子進(jìn)入發(fā)酵液后適應(yīng)快，可以縮短發(fā)酵繁殖至高峰所需時間，種子液中含有大量的水解酶，使產(chǎn)物合成速度加快。大接種量往往使菌種生長過快，造成營養(yǎng)基質(zhì)缺乏或溶解氧不足而不利于發(fā)酵；接種量不足，則會引起發(fā)酵前期菌絲量少、菌體生長緩慢，使發(fā)酵周期延長，還可能產(chǎn)生菌絲團(tuán)，導(dǎo)致發(fā)酵異常等。不同的接種量（3%～24%）對香菇液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的生物量及粗多糖產(chǎn)量的綜合影響結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，在接種量3%～12%范圍內(nèi)，香菇生物量與總粗多糖產(chǎn)量均隨著接種量的增加而增加，增長趨勢顯著，而在接種量大于12%以后，生物量及粗多糖產(chǎn)量增幅不大，在產(chǎn)物不增加情況下增加接種量意味著增加發(fā)酵成本，因此初步確定香菇液態(tài)發(fā)酵適宜接種量為12%。

2.2 初始pH 值對香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

pH值的高低直接影響菌絲體的新陳代謝，導(dǎo)致微生物細(xì)胞膜的電荷變化，影響代謝過程中酶的活性，從而影響生物量和多糖代謝產(chǎn)物。本試驗設(shè)計初始發(fā)酵液不同的pH值3～7.5對香菇生物量及粗多糖產(chǎn)量的影響（圖2），結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵初始pH值為5.0時，香菇菌絲體生物量與粗多糖產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為17.58、1.76 g/L。當(dāng)pH值高于5.0時生物量與粗多糖產(chǎn)量下降明顯，表明香菇菌絲適宜生長在偏酸性環(huán)境，pH值5.0是香菇液態(tài)發(fā)酵較適pH值。

2.3 發(fā)酵溫度對香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

試驗以不同發(fā)酵溫度9～36 ℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定對香菇生物量及粗多糖產(chǎn)量的影響（圖3），結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵溫度從 9 ℃ 升至24 ℃時，香菇生物量與粗多糖產(chǎn)量均隨著溫度升高而增加，在24 ℃時粗多糖產(chǎn)量最高，為1.77 g/L。當(dāng)發(fā)酵溫度超過24 ℃時，粗多糖產(chǎn)量有下降趨勢；當(dāng)發(fā)酵溫度為27 ℃時，生物量最高，為17.57 g/L。溫度高于27 ℃，生物量開始下降，因溫度過高會導(dǎo)致微生物代謝加快，自身物質(zhì)消耗過快，生物量、粗多糖產(chǎn)量呈下降趨勢；高溫發(fā)酵生物熱增速較快，可促進(jìn)菌種老化，從而影響生物量增加和粗多糖的生物合成。初步選定香菇菌液體培養(yǎng)適宜發(fā)酵溫度為24 ℃。

2.4 搖床轉(zhuǎn)速對香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

不同轉(zhuǎn)速（120～200 r/min）條件下，液態(tài)發(fā)酵試驗結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)轉(zhuǎn)速從120 r/min升至160 r/min時，香菇生物量及香菇粗多糖產(chǎn)量呈上升趨勢；當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到160 r/min時菌絲體生物量和粗多糖產(chǎn)量均達(dá)最高，分別為17.45、1.73 g/L。轉(zhuǎn)速超過160 r/min時，菌絲生物量及粗多糖產(chǎn)量略有下降趨勢，因增加轉(zhuǎn)速雖然有利于增加溶氧和通氣效果，但增加了菌絲球相互間的摩擦和剪切作用，加大對菌絲球的機(jī)械刺激，從而影響生物量的增加。初步確定適合香菇菌絲生長的搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

2.5 香菇液體發(fā)酵條件響應(yīng)面法分析

從單因素試驗結(jié)果看出，香菇粗多糖產(chǎn)量與菌絲生物量變化趨勢較為一致，因此優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵條件時選擇菌絲生物量作為量化指標(biāo)，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗，選取對生物量影響較大的接種量、pH值和培養(yǎng)溫度3個因素作為響應(yīng)面法的試驗因素，分別以A、B、C表示，每個因素的低、中、高試驗水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，試驗因素水平編碼如表1所示，Box-Behnken 設(shè)計方案及試驗結(jié)果見表2。為研究影響因素間的曲面效應(yīng)，利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及響應(yīng)曲面見圖5至圖7。結(jié)果表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，均有最大響應(yīng)值出現(xiàn)。

圖5結(jié)果表明，接種量和pH值對生物量的影響，響應(yīng)面圖可以看出接種量曲面和pH值曲面變化幅度均較明顯，說明接種量和pH值對生物量的影響較為顯著，與二次回歸擬合方差分析結(jié)果一致，響應(yīng)面的最高點同時也是等高線中的最小圖形的中心點。從等高線圖可以看出，圖形接近圓形，說明pH值和接種量交互作用不顯著。

圖6結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度和pH 值對生物量的影響，可以看出培養(yǎng)溫度曲面變化幅度不大，pH 值曲面變化幅度較大，說明pH 值對生物量的影響較為顯著，當(dāng)pH 值和培養(yǎng)溫度較低或較高時，都會降低香菇菌絲的生物量。從等高線圖可以看出，培養(yǎng)溫度和pH 值交互作用相對顯著。響應(yīng)面的最高點同時也是等高線中的最小橢圓的中心點。

接種量和培養(yǎng)溫度對菌絲生物量的影響見圖7。從圖7可見，培養(yǎng)溫度曲面變化幅度不大，接種量曲面變化幅度較大，說明接種量對生物量的影響較為顯著，對同一等高線橢圓曲線分析，接種量變化很小區(qū)域需要培養(yǎng)溫度較大區(qū)域的變化，培養(yǎng)溫度和接種量對菌絲生物量的交互影響相對顯著。

2.6 最佳培養(yǎng)條件的預(yù)測和試驗驗證

根據(jù)Design Expert建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)的最優(yōu)化分析，得出香菇液態(tài)發(fā)酵的優(yōu)化條件為接種量12.42%、pH 值4.96、發(fā)酵溫度24.11 ℃。在此條件下，香菇生物量理論上可達(dá)17.58 g/L。為驗證該法的可行性，采用上述優(yōu)化發(fā)酵條件進(jìn)行香菇液態(tài)發(fā)酵試驗，為方便試驗操作，將上述優(yōu)化發(fā)酵溫度調(diào)整為24 ℃，在單因素試驗測得的最適轉(zhuǎn)速 160 r/min 條件下，按照優(yōu)化條件做3組平行試驗，測得香菇菌絲生物量實際平均值為17.76 g/L，試驗結(jié)果與模型預(yù)測相差1.02%。

3 討論與結(jié)論

以菌絲生物量和粗多糖產(chǎn)量為量化指標(biāo)，對香菇液態(tài)發(fā)酵的接種量、培養(yǎng)溫度、pH值、轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素試驗，在此基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵試驗，建立了接種量、pH值、培養(yǎng)溫度3個因素和響應(yīng)值菌體生物量之間的數(shù)學(xué)模型，研究用響應(yīng)面法確定香菇液態(tài)發(fā)酵條件的可行性。結(jié)果表明，建立的模型的回歸效果顯著，能很好地預(yù)測菌絲體的生物量。確定優(yōu)化發(fā)酵條件接種量為12.42%、pH 值為4.96、發(fā)酵溫度為 24.11 ℃，按照此優(yōu)化條件實測菌絲體生物量為17.76 g/L，與理論值相差1.02%。表明采用響應(yīng)面法對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和條件優(yōu)化能很好地預(yù)測香菇液態(tài)發(fā)酵條件，具有一定的可行性和實用價值。

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2.2 初始pH 值對香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

pH值的高低直接影響菌絲體的新陳代謝，導(dǎo)致微生物細(xì)胞膜的電荷變化，影響代謝過程中酶的活性，從而影響生物量和多糖代謝產(chǎn)物。本試驗設(shè)計初始發(fā)酵液不同的pH值3～7.5對香菇生物量及粗多糖產(chǎn)量的影響（圖2），結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵初始pH值為5.0時，香菇菌絲體生物量與粗多糖產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為17.58、1.76 g/L。當(dāng)pH值高于5.0時生物量與粗多糖產(chǎn)量下降明顯，表明香菇菌絲適宜生長在偏酸性環(huán)境，pH值5.0是香菇液態(tài)發(fā)酵較適pH值。

2.3 發(fā)酵溫度對香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

試驗以不同發(fā)酵溫度9～36 ℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定對香菇生物量及粗多糖產(chǎn)量的影響（圖3），結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵溫度從 9 ℃ 升至24 ℃時，香菇生物量與粗多糖產(chǎn)量均隨著溫度升高而增加，在24 ℃時粗多糖產(chǎn)量最高，為1.77 g/L。當(dāng)發(fā)酵溫度超過24 ℃時，粗多糖產(chǎn)量有下降趨勢；當(dāng)發(fā)酵溫度為27 ℃時，生物量最高，為17.57 g/L。溫度高于27 ℃，生物量開始下降，因溫度過高會導(dǎo)致微生物代謝加快，自身物質(zhì)消耗過快，生物量、粗多糖產(chǎn)量呈下降趨勢；高溫發(fā)酵生物熱增速較快，可促進(jìn)菌種老化，從而影響生物量增加和粗多糖的生物合成。初步選定香菇菌液體培養(yǎng)適宜發(fā)酵溫度為24 ℃。

2.4 搖床轉(zhuǎn)速對香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

不同轉(zhuǎn)速（120～200 r/min）條件下，液態(tài)發(fā)酵試驗結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)轉(zhuǎn)速從120 r/min升至160 r/min時，香菇生物量及香菇粗多糖產(chǎn)量呈上升趨勢；當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到160 r/min時菌絲體生物量和粗多糖產(chǎn)量均達(dá)最高，分別為17.45、1.73 g/L。轉(zhuǎn)速超過160 r/min時，菌絲生物量及粗多糖產(chǎn)量略有下降趨勢，因增加轉(zhuǎn)速雖然有利于增加溶氧和通氣效果，但增加了菌絲球相互間的摩擦和剪切作用，加大對菌絲球的機(jī)械刺激，從而影響生物量的增加。初步確定適合香菇菌絲生長的搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

2.5 香菇液體發(fā)酵條件響應(yīng)面法分析

從單因素試驗結(jié)果看出，香菇粗多糖產(chǎn)量與菌絲生物量變化趨勢較為一致，因此優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵條件時選擇菌絲生物量作為量化指標(biāo)，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗，選取對生物量影響較大的接種量、pH值和培養(yǎng)溫度3個因素作為響應(yīng)面法的試驗因素，分別以A、B、C表示，每個因素的低、中、高試驗水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，試驗因素水平編碼如表1所示，Box-Behnken 設(shè)計方案及試驗結(jié)果見表2。為研究影響因素間的曲面效應(yīng)，利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及響應(yīng)曲面見圖5至圖7。結(jié)果表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，均有最大響應(yīng)值出現(xiàn)。

圖5結(jié)果表明，接種量和pH值對生物量的影響，響應(yīng)面圖可以看出接種量曲面和pH值曲面變化幅度均較明顯，說明接種量和pH值對生物量的影響較為顯著，與二次回歸擬合方差分析結(jié)果一致，響應(yīng)面的最高點同時也是等高線中的最小圖形的中心點。從等高線圖可以看出，圖形接近圓形，說明pH值和接種量交互作用不顯著。

圖6結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度和pH 值對生物量的影響，可以看出培養(yǎng)溫度曲面變化幅度不大，pH 值曲面變化幅度較大，說明pH 值對生物量的影響較為顯著，當(dāng)pH 值和培養(yǎng)溫度較低或較高時，都會降低香菇菌絲的生物量。從等高線圖可以看出，培養(yǎng)溫度和pH 值交互作用相對顯著。響應(yīng)面的最高點同時也是等高線中的最小橢圓的中心點。

接種量和培養(yǎng)溫度對菌絲生物量的影響見圖7。從圖7可見，培養(yǎng)溫度曲面變化幅度不大，接種量曲面變化幅度較大，說明接種量對生物量的影響較為顯著，對同一等高線橢圓曲線分析，接種量變化很小區(qū)域需要培養(yǎng)溫度較大區(qū)域的變化，培養(yǎng)溫度和接種量對菌絲生物量的交互影響相對顯著。

2.6 最佳培養(yǎng)條件的預(yù)測和試驗驗證

根據(jù)Design Expert建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)的最優(yōu)化分析，得出香菇液態(tài)發(fā)酵的優(yōu)化條件為接種量12.42%、pH 值4.96、發(fā)酵溫度24.11 ℃。在此條件下，香菇生物量理論上可達(dá)17.58 g/L。為驗證該法的可行性，采用上述優(yōu)化發(fā)酵條件進(jìn)行香菇液態(tài)發(fā)酵試驗，為方便試驗操作，將上述優(yōu)化發(fā)酵溫度調(diào)整為24 ℃，在單因素試驗測得的最適轉(zhuǎn)速 160 r/min 條件下，按照優(yōu)化條件做3組平行試驗，測得香菇菌絲生物量實際平均值為17.76 g/L，試驗結(jié)果與模型預(yù)測相差1.02%。

3 討論與結(jié)論

以菌絲生物量和粗多糖產(chǎn)量為量化指標(biāo)，對香菇液態(tài)發(fā)酵的接種量、培養(yǎng)溫度、pH值、轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素試驗，在此基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵試驗，建立了接種量、pH值、培養(yǎng)溫度3個因素和響應(yīng)值菌體生物量之間的數(shù)學(xué)模型，研究用響應(yīng)面法確定香菇液態(tài)發(fā)酵條件的可行性。結(jié)果表明，建立的模型的回歸效果顯著，能很好地預(yù)測菌絲體的生物量。確定優(yōu)化發(fā)酵條件接種量為12.42%、pH 值為4.96、發(fā)酵溫度為 24.11 ℃，按照此優(yōu)化條件實測菌絲體生物量為17.76 g/L，與理論值相差1.02%。表明采用響應(yīng)面法對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和條件優(yōu)化能很好地預(yù)測香菇液態(tài)發(fā)酵條件，具有一定的可行性和實用價值。

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2.2 初始pH 值對香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

pH值的高低直接影響菌絲體的新陳代謝，導(dǎo)致微生物細(xì)胞膜的電荷變化，影響代謝過程中酶的活性，從而影響生物量和多糖代謝產(chǎn)物。本試驗設(shè)計初始發(fā)酵液不同的pH值3～7.5對香菇生物量及粗多糖產(chǎn)量的影響（圖2），結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵初始pH值為5.0時，香菇菌絲體生物量與粗多糖產(chǎn)量均達(dá)到最大值，分別為17.58、1.76 g/L。當(dāng)pH值高于5.0時生物量與粗多糖產(chǎn)量下降明顯，表明香菇菌絲適宜生長在偏酸性環(huán)境，pH值5.0是香菇液態(tài)發(fā)酵較適pH值。

2.3 發(fā)酵溫度對香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

試驗以不同發(fā)酵溫度9～36 ℃進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，測定對香菇生物量及粗多糖產(chǎn)量的影響（圖3），結(jié)果表明，當(dāng)發(fā)酵溫度從 9 ℃ 升至24 ℃時，香菇生物量與粗多糖產(chǎn)量均隨著溫度升高而增加，在24 ℃時粗多糖產(chǎn)量最高，為1.77 g/L。當(dāng)發(fā)酵溫度超過24 ℃時，粗多糖產(chǎn)量有下降趨勢；當(dāng)發(fā)酵溫度為27 ℃時，生物量最高，為17.57 g/L。溫度高于27 ℃，生物量開始下降，因溫度過高會導(dǎo)致微生物代謝加快，自身物質(zhì)消耗過快，生物量、粗多糖產(chǎn)量呈下降趨勢；高溫發(fā)酵生物熱增速較快，可促進(jìn)菌種老化，從而影響生物量增加和粗多糖的生物合成。初步選定香菇菌液體培養(yǎng)適宜發(fā)酵溫度為24 ℃。

2.4 搖床轉(zhuǎn)速對香菇液態(tài)發(fā)酵的影響

不同轉(zhuǎn)速（120～200 r/min）條件下，液態(tài)發(fā)酵試驗結(jié)果（圖4）表明，當(dāng)轉(zhuǎn)速從120 r/min升至160 r/min時，香菇生物量及香菇粗多糖產(chǎn)量呈上升趨勢；當(dāng)轉(zhuǎn)速達(dá)到160 r/min時菌絲體生物量和粗多糖產(chǎn)量均達(dá)最高，分別為17.45、1.73 g/L。轉(zhuǎn)速超過160 r/min時，菌絲生物量及粗多糖產(chǎn)量略有下降趨勢，因增加轉(zhuǎn)速雖然有利于增加溶氧和通氣效果，但增加了菌絲球相互間的摩擦和剪切作用，加大對菌絲球的機(jī)械刺激，從而影響生物量的增加。初步確定適合香菇菌絲生長的搖床轉(zhuǎn)速為160 r/min。

2.5 香菇液體發(fā)酵條件響應(yīng)面法分析

從單因素試驗結(jié)果看出，香菇粗多糖產(chǎn)量與菌絲生物量變化趨勢較為一致，因此優(yōu)化液態(tài)發(fā)酵條件時選擇菌絲生物量作為量化指標(biāo)，根據(jù)Box-Benhnken的中心組合試驗設(shè)計原理，綜合單因素試驗，選取對生物量影響較大的接種量、pH值和培養(yǎng)溫度3個因素作為響應(yīng)面法的試驗因素，分別以A、B、C表示，每個因素的低、中、高試驗水平分別以-1、0、1進(jìn)行編碼，試驗因素水平編碼如表1所示，Box-Behnken 設(shè)計方案及試驗結(jié)果見表2。為研究影響因素間的曲面效應(yīng)，利用Design Expert軟件對表2數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，所得到的二次回歸方程的等高線及響應(yīng)曲面見圖5至圖7。結(jié)果表明，在所選因素水平范圍內(nèi)，均有最大響應(yīng)值出現(xiàn)。

圖5結(jié)果表明，接種量和pH值對生物量的影響，響應(yīng)面圖可以看出接種量曲面和pH值曲面變化幅度均較明顯，說明接種量和pH值對生物量的影響較為顯著，與二次回歸擬合方差分析結(jié)果一致，響應(yīng)面的最高點同時也是等高線中的最小圖形的中心點。從等高線圖可以看出，圖形接近圓形，說明pH值和接種量交互作用不顯著。

圖6結(jié)果表明，培養(yǎng)溫度和pH 值對生物量的影響，可以看出培養(yǎng)溫度曲面變化幅度不大，pH 值曲面變化幅度較大，說明pH 值對生物量的影響較為顯著，當(dāng)pH 值和培養(yǎng)溫度較低或較高時，都會降低香菇菌絲的生物量。從等高線圖可以看出，培養(yǎng)溫度和pH 值交互作用相對顯著。響應(yīng)面的最高點同時也是等高線中的最小橢圓的中心點。

接種量和培養(yǎng)溫度對菌絲生物量的影響見圖7。從圖7可見，培養(yǎng)溫度曲面變化幅度不大，接種量曲面變化幅度較大，說明接種量對生物量的影響較為顯著，對同一等高線橢圓曲線分析，接種量變化很小區(qū)域需要培養(yǎng)溫度較大區(qū)域的變化，培養(yǎng)溫度和接種量對菌絲生物量的交互影響相對顯著。

2.6 最佳培養(yǎng)條件的預(yù)測和試驗驗證

根據(jù)Design Expert建立的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行參數(shù)的最優(yōu)化分析，得出香菇液態(tài)發(fā)酵的優(yōu)化條件為接種量12.42%、pH 值4.96、發(fā)酵溫度24.11 ℃。在此條件下，香菇生物量理論上可達(dá)17.58 g/L。為驗證該法的可行性，采用上述優(yōu)化發(fā)酵條件進(jìn)行香菇液態(tài)發(fā)酵試驗，為方便試驗操作，將上述優(yōu)化發(fā)酵溫度調(diào)整為24 ℃，在單因素試驗測得的最適轉(zhuǎn)速 160 r/min 條件下，按照優(yōu)化條件做3組平行試驗，測得香菇菌絲生物量實際平均值為17.76 g/L，試驗結(jié)果與模型預(yù)測相差1.02%。

3 討論與結(jié)論

以菌絲生物量和粗多糖產(chǎn)量為量化指標(biāo)，對香菇液態(tài)發(fā)酵的接種量、培養(yǎng)溫度、pH值、轉(zhuǎn)速進(jìn)行單因素試驗，在此基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面優(yōu)化發(fā)酵試驗，建立了接種量、pH值、培養(yǎng)溫度3個因素和響應(yīng)值菌體生物量之間的數(shù)學(xué)模型，研究用響應(yīng)面法確定香菇液態(tài)發(fā)酵條件的可行性。結(jié)果表明，建立的模型的回歸效果顯著，能很好地預(yù)測菌絲體的生物量。確定優(yōu)化發(fā)酵條件接種量為12.42%、pH 值為4.96、發(fā)酵溫度為 24.11 ℃，按照此優(yōu)化條件實測菌絲體生物量為17.76 g/L，與理論值相差1.02%。表明采用響應(yīng)面法對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸分析和條件優(yōu)化能很好地預(yù)測香菇液態(tài)發(fā)酵條件，具有一定的可行性和實用價值。

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