不同直徑卵泡對(duì)綿羊卵母細(xì)胞體外發(fā)育能力的影響

張利等

摘要：以屠宰場(chǎng)綿羊卵巢為材料，采用抽吸法收集小卵泡、中卵泡、大卵泡卵母細(xì)胞，研究不同卵泡直徑對(duì)卵母細(xì)胞回收效果、比例分布以及對(duì)卵母細(xì)胞直徑、谷胱甘肽（GSH）含量和體外發(fā)育能力的影響。結(jié)果表明，3種卵泡卵母細(xì)胞比例分布差異極顯著（P<0.01）；3種卵泡卵母細(xì)胞的回收率無顯著差異（P>0.05），但中、大卵泡卵母細(xì)胞可用率極顯著高于小卵泡卵母細(xì)胞（P<0.01）；小卵泡卵母細(xì)胞的直徑極顯著小于中、大卵泡卵母細(xì)胞（P<0.01）；中、大卵泡卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)24 h后GSH含量顯著高于小卵泡卵母細(xì)胞（P<0.05）；經(jīng)孤雌激活體外培養(yǎng)后，中、大卵泡卵母細(xì)胞的成熟率分別極顯著（P<0.01）、顯著（P<0.05）高于小卵泡卵母細(xì)胞，中、大卵泡卵母細(xì)胞囊胚率極顯著高于小卵泡卵母細(xì)胞（P<001）；中卵泡卵母細(xì)胞囊胚細(xì)胞總數(shù)顯著高于小卵泡卵母細(xì)胞（P<0.05），但與大卵泡卵母細(xì)胞差異不顯著（P>005）。因此，直徑≥2 mm的卵泡的卵母細(xì)胞適合體外培養(yǎng)和體外胚胎的生產(chǎn)。

關(guān)鍵詞：卵泡直徑；綿羊；卵母細(xì)胞；孤雌激活

中圖分類號(hào)： S826.3 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0141-04

隨著哺乳動(dòng)物體外受精、克隆、轉(zhuǎn)基因等生物技術(shù)研究的不斷深入，對(duì)動(dòng)物卵母細(xì)胞的數(shù)量、質(zhì)量要求越來越高。目前，胚胎體外生產(chǎn)（in vitro production，IVP）的卵母細(xì)胞主要來源于屠宰場(chǎng)收集的卵巢，由于屠宰動(dòng)物的年齡及卵巢表面卵泡的大小等存在差異，培養(yǎng)后獲得的胚胎質(zhì)量也有很大差異[1]，一般收集的卵泡卵母細(xì)胞囊胚率都很低[2]。與體內(nèi)自然成熟的卵母細(xì)胞相比，體外培養(yǎng)的卵母細(xì)胞成熟率、受精率和早期胚胎發(fā)育能力呈現(xiàn)不同程度的下降趨勢(shì)。在體內(nèi)，卵母細(xì)胞在卵泡內(nèi)發(fā)育成熟，作為卵母細(xì)胞的生長(zhǎng)環(huán)境，卵泡的大小對(duì)卵母細(xì)胞的成熟和后期發(fā)育潛力起著至關(guān)重要的作用[3]。Crozet等早期報(bào)道，不同直徑卵泡中的卵母細(xì)胞發(fā)育能力不同，所以研究卵泡大小對(duì)后期發(fā)育潛力的影響十分必要[4]。目前，國(guó)內(nèi)外很多研究者只報(bào)道了山羊[5-6]、牛[3]的卵泡大小對(duì)卵母細(xì)胞發(fā)育的影響，且國(guó)內(nèi)還未見對(duì)綿羊的報(bào)道。本研究分析卵泡直徑對(duì)卵母細(xì)胞的回收效果、比例分布以及對(duì)卵母細(xì)胞直徑、谷胱甘肽（GSH）含量和體外發(fā)育能力的影響，以期為胚胎工程中卵子的來源和選擇提供基礎(chǔ)依據(jù)，并提高體外生產(chǎn)胚胎的水平。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 藥品及試劑 本研究所用化學(xué)試劑除特殊說明外均購(gòu)自Sigma公司；培養(yǎng)用胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（NEAA）購(gòu)自Gibco公司；牛血清白蛋白（BSA）購(gòu)自Bovogen公司。

1.1.2 卵巢采集 卵巢采集于新疆維吾爾自治區(qū)烏魯木齊市華凌屠宰場(chǎng)。母羊屠宰后立即剖腹取出卵巢，置于37～38 ℃含青霉素、鏈霉素（雙抗）的生理鹽水中，2～3 h內(nèi)送至實(shí)驗(yàn)室；用約38.5 ℃、含有雙抗的生理鹽水洗滌2～3次，以滅菌的吸水紙吸干后，用帶9號(hào)針頭的吸有1～2 mL抽卵液的10 mL注射器分別抽取<2 mm（小卵泡）、2～5 mm（中卵泡）、>5 mm（大卵泡）的卵泡中的卵泡液；分別在體式鏡下挑選出卵丘細(xì)胞包裹3層以上、結(jié)構(gòu)致密的卵母細(xì)胞-卵丘細(xì)胞復(fù)合體（cumulus oocyte complexes，COCs），移入抽卵液中洗3次。

1.2 方法

1.2.1 卵母細(xì)胞的體外成熟培養(yǎng) 將各組卵母細(xì)胞分別用抽卵液洗滌3次后，再用體外成熟（in vitro maturation，IVM）液洗滌3次，按20～30枚/滴移入100 μL提前5～6 h平衡好的IVM液滴內(nèi)，在38.6 ℃、5% CO2及飽和濕度條件下進(jìn)行成熟培養(yǎng)。液體配制如下：抽卵液：Hepes-199+2%FBS+ 6 U/mL 肝素鈉+100 U/mL雙抗；IVM：TCM199+0.05 U/mL FSH+10%FBS+1 μg/mL雌激素+10 ng/mL EGF+0.1 mmol/L半胱胺酸+24.2 mg/mL丙酮酸鈉+100 U/mL雙抗。

1.2.2 去除卵丘細(xì)胞 卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)22～24 h后，將卵母細(xì)胞在含0.1%透明質(zhì)酸酶的Hepes-199中用吸管反復(fù)吹打去除全部卵丘細(xì)胞，在體視鏡下挑出排出第一極體的卵母細(xì)胞用于后期培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)體外培養(yǎng)成熟率。

1.2.3 卵母細(xì)胞孤雌激活 挑選出有極體且細(xì)胞質(zhì)均勻的卵母細(xì)胞在含5 μmol/L離子霉素（ionomycin）的激活液中激活4 min，經(jīng)2 mmol/L 6-DMAP培養(yǎng)液洗2次后，移入含 6-DMAP 的培養(yǎng)液內(nèi)培養(yǎng)2 h，培養(yǎng)液洗滌3次后移入含有 600～700 μL 體外培養(yǎng)液的四孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)，CO2箱培養(yǎng)條件為38.6 ℃、5%CO2、5%O2、90% N2及飽和濕度，培養(yǎng) 48 h 后統(tǒng)計(jì)卵裂率，培養(yǎng)6～8 d統(tǒng)計(jì)囊胚率。

1.2.4 囊胚Hoechst細(xì)胞染色 取7 d的囊胚，將囊胚轉(zhuǎn)移到含10 μg/mL Hoechst33342的抽卵液內(nèi)避光孵育7～10 min，再將囊胚轉(zhuǎn)移到載玻片上，盡量少帶液體，蓋上蓋玻片，用凡士林封片，在倒置顯微鏡的紫外光下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件的 One-way ANOVA方法進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同卵泡直徑的比例

隨機(jī)從一批卵巢中抽取約40個(gè)卵巢進(jìn)行樣本統(tǒng)計(jì)，分成3種卵泡，卵泡直徑<2 mm（小卵泡）、2～5 mm（中卵泡）、>5 mm（大卵泡）3組間差異極顯著（P<0.01）（表1）。

2.3 不同直徑卵泡中卵母細(xì)胞直徑的比較

抽取不同直徑卵泡的卵母細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后分別脫卵丘后使用尼康（NIS-Element D3.1）系統(tǒng)軟件進(jìn)行直徑測(cè)定，結(jié)果如圖1所示，中卵泡和大卵泡卵母細(xì)胞的直徑差異不顯著（P>0.05），但均極顯著高于小卵泡卵母細(xì)胞的直徑（P<001）。endprint

2.4 不同直徑卵泡中卵母細(xì)胞GSH含量的比較

抽取不同直徑卵泡的卵母細(xì)胞，培養(yǎng)24 h后分別脫卵丘后進(jìn)行GSH含量測(cè)定（采用江蘇碧云天公司生產(chǎn)的GSH和GSSG檢測(cè)試劑盒），結(jié)果如圖2所示，隨著卵泡直徑增大，GSH含量增加，中卵泡和大卵泡卵母細(xì)胞的GSH含量差異不顯著（P>0.05），但均顯著高于小卵泡卵母細(xì)胞的GSH含量（P<0.05）。

2.5 卵泡直徑對(duì)卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響

為了比較卵泡直徑對(duì)卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)效果的影響，將回收的3組卵泡卵母細(xì)胞分別成熟培養(yǎng)并孤雌激活，結(jié)果如表3所示，小卵泡卵母細(xì)胞的成熟率極顯著低于中卵泡卵母細(xì)胞（P<0.01），也顯著低于大卵泡卵母細(xì)胞（P<0.05）；3組卵泡卵母細(xì)胞卵裂率差異不顯著（P>0.05）；小卵泡卵母細(xì)胞囊胚率極顯著低于中卵泡和大卵泡（P<0.01），后兩者之間差異不顯著（P>0.05）；中卵泡卵母細(xì)胞囊胚細(xì)胞總數(shù)顯著高于小卵泡（P<0.05），與大卵泡差異不顯著（P>0.05）。

3 討論

3.1 卵泡直徑對(duì)卵泡比例分布的影響

同一卵巢上的卵泡比例分布還未曾有人報(bào)道。綿羊是常見的季節(jié)性發(fā)情動(dòng)物，其最主要的發(fā)情時(shí)間集中在9—12月。由于受日照時(shí)間和體內(nèi)激素水平的影響，在非繁殖季節(jié)和繁殖季節(jié)，卵巢表面的卵泡大小有所不同。非繁殖季節(jié)主要為中、小卵泡，中、大卵泡通常在每個(gè)卵巢上最多只有2個(gè)[7]。本研究結(jié)果表明，同一卵巢表面小卵泡（小于2 mm）占的比例較多，隨著卵泡直徑增大，中卵泡（2～5 mm）和大卵泡（大于5 mm）占的比例越來越少，小卵泡、中卵泡和大卵泡3組間差異極顯著，這可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)是在非繁殖季節(jié)所統(tǒng)計(jì)。

3.2 不同卵泡直徑對(duì)卵母細(xì)胞回收效果的影響

田長(zhǎng)永等報(bào)道，山羊不同直徑卵泡卵母細(xì)胞的回收率無差異，但在可用率方面，大卵泡卵母細(xì)胞極顯著高于小卵泡[6]，本研究結(jié)果與該結(jié)論一致。隨著卵泡直徑的增大和體內(nèi)激素的變化，卵泡腔變大，卵泡液增多，顆粒細(xì)胞將卵母細(xì)胞包裹得更加緊密[8]。本研究中，隨著卵泡增大，回收率和可用率都在增加，僅個(gè)別的卵母細(xì)胞有退化現(xiàn)象，這與Heighington等的研究結(jié)果[9]基本一致，大卵泡的回收率和利用率達(dá)到最高，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)小卵泡卵母細(xì)胞極易抽成裸卵。究其原因，一是小卵泡的卵泡液較少，卵丘卵母復(fù)合體（COCs）和周圍的卵巢組織聯(lián)系比較緊密，大部分顆粒細(xì)胞和卵泡相連，在抽吸的過程中易于抽裸，而大卵泡卵泡液較多，僅有一小部分顆粒細(xì)胞和卵泡相連，卵母細(xì)胞接近游離狀態(tài)，易于回收；二是大卵泡的卵泡液較多，在抽吸的過程可能會(huì)起到一定緩沖作用，減少了針頭對(duì)COCs的機(jī)械損傷，而小卵泡卵泡液較少，損傷程度可能較大，所以大卵泡和中卵泡的可用率明顯高于小卵泡。這說明卵泡直徑顯著影響卵母細(xì)胞的回收利用效果。

3.3 不同直徑卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞直徑、GSH含量與卵母細(xì)胞成熟的關(guān)系

有許多研究者認(rèn)為，卵母細(xì)胞的直徑大小也是其成熟的指標(biāo)之一。Anguita等報(bào)道，卵母細(xì)胞直徑比卵泡直徑更能反應(yīng)其成熟和發(fā)育能力[10]。Izumi等報(bào)道，貓?bào)w內(nèi)卵母細(xì)胞與卵泡同步發(fā)育[11]。在早期，Crozet等報(bào)道，卵母細(xì)胞只有達(dá)到一定直徑（家畜約110 μm）后才獲得完成減數(shù)分裂發(fā)育到MⅡ期的能力[4]，牛直徑110 μm、豬直徑l15 μm 的卵母細(xì)胞可以完成減數(shù)分裂發(fā)育至核成熟[12]。本研究結(jié)果表明，培養(yǎng)24 h后，隨著卵泡的增大，卵母細(xì)胞直徑有所增加，中卵泡卵母細(xì)胞的直徑（115.5 μm）比大卵泡卵母細(xì)胞的直徑（115.1 μm）長(zhǎng)約0.4 μm，但都極顯著大于小卵泡卵母細(xì)胞的直徑（111.8 μm），與早期報(bào)道的牛的卵母細(xì)胞直徑長(zhǎng)度[12]基本一致。在成熟率上，小卵泡卵母細(xì)胞極顯著低于中卵泡卵母細(xì)胞，并顯著低于大卵泡卵母細(xì)胞，小卵泡卵母細(xì)胞直徑和成熟率都低于中卵泡和大卵泡，可見卵母細(xì)胞直徑的大小可以間接反映其成熟情況。此外，也有研究者認(rèn)為體外成熟后卵母細(xì)胞內(nèi)GSH含量也可作為卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的標(biāo)志[13]。Abdoon等研究表明，培養(yǎng)后排第二極體卵母細(xì)胞的GSH含量明顯高于未成熟的卵母細(xì)胞[14]。本研究結(jié)果表明，小卵泡卵母細(xì)胞內(nèi)GSH含量顯著低于中卵泡和大卵泡，結(jié)合上文提到的各組間卵母細(xì)胞的成熟率，說明卵泡卵母細(xì)胞內(nèi)GSH含量也是其成熟的重要指標(biāo)之一。

3.4 卵泡直徑對(duì)卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)效果的影響

在體內(nèi)，隨著卵泡直徑增大，RNA逐漸在卵母細(xì)胞內(nèi)蓄積，只有在較大的卵泡（≥2 mm）中卵母細(xì)胞才能儲(chǔ)存足夠量的RNA，以維持隨后的體外受精和發(fā)育。小于2 mm卵泡內(nèi)的COCs因周圍環(huán)境中缺乏某些因子而限制了后期的發(fā)育[15]。早期Crozet等對(duì)山羊的研究結(jié)果顯示，直徑小于 3 mm 卵泡卵母細(xì)胞能完成體外成熟和體外受精，但受精卵一般只能發(fā)育到8細(xì)胞期或16細(xì)胞期，而大卵泡卵母細(xì)胞受精卵基本都能發(fā)育到桑葚胚或囊胚[4]。本研究結(jié)果表明，在成熟率上，小卵泡卵母細(xì)胞極顯著低于中卵泡卵母細(xì)胞，并顯著低于大卵泡卵母細(xì)胞，與Feng等的研究結(jié)果[15]類似。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)小卵泡卵母細(xì)胞在體外成熟培養(yǎng)時(shí)，死亡現(xiàn)象明顯多于中、大卵泡卵母細(xì)胞，可能是因?yàn)樾÷雅萋涯讣?xì)胞體內(nèi)的RNA或其他物質(zhì)合成儲(chǔ)存不足，不適宜培養(yǎng)，而直徑較大卵泡卵母細(xì)胞在體內(nèi)已趨于易于成熟的階段；但是并沒有出現(xiàn)像Pavlok等提出的過度成熟而導(dǎo)致的老化現(xiàn)象[16]。在卵裂率上，隨著卵泡直徑增大，卵裂率增加，但各組間無顯著差異，這與Crozet等的結(jié)果[4]不符，可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)做的是孤雌激活，沒有做體外受精，還有可能是由山羊與綿羊之間的物種差異造成的。在囊胚率上，隨著卵泡直徑增大，囊胚率升高，中、大卵泡卵母細(xì)胞之間差異不顯著，但都極顯著高于小卵泡卵母細(xì)胞，即小卵泡卵母細(xì)胞基本獲得了核成熟能力（排第二極體），能夠完成受精和卵裂；但只有中、大卵泡卵母細(xì)胞才能進(jìn)一步支持受精卵發(fā)育到囊胚，這與Han等[17]、Crozet等[4]的研究結(jié)果類似。此外，很多研究者在做卵泡直徑對(duì)卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響研究時(shí)，基本都只是培養(yǎng)到囊胚階段，而在本研究中又繼續(xù)對(duì)囊胚Hoechst細(xì)胞染色。早期Brison等研究表明，囊胚細(xì)胞數(shù)是評(píng)價(jià)胚胎發(fā)育質(zhì)量的一個(gè)重要指標(biāo)，內(nèi)細(xì)胞數(shù)越多越易于附植和妊娠[18]。本研究結(jié)果顯示，中卵泡卵母細(xì)胞的囊胚細(xì)胞總數(shù)顯著高于小卵泡組，但與大卵泡組差異不顯著。本研究結(jié)果比牛[19]、小鼠[20]未分卵泡直徑但利用BCB篩選、體外受精的對(duì)照組囊胚總細(xì)胞數(shù)高，主要原因可能是孤雌激活的囊胚細(xì)胞總數(shù)本身就比體外受精的高（本實(shí)驗(yàn)室得到孤雌激活的囊胚細(xì)胞總數(shù)比體外受精的高），也有可能是不同物種的差異造成，具體原因還需繼續(xù)研究?？梢娐雅葜睆綄?duì)卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)效果有顯著影響，中、大卵泡的卵母細(xì)胞有更大的體外發(fā)育潛力。endprint

4 結(jié)論

綜上所述，本研究認(rèn)為，同一卵巢的表面可回收利用的卵母細(xì)胞數(shù)量有限，卵巢表面卵泡直徑≥2 mm的卵母細(xì)胞可以作為卵子的主要來源，并且能夠生產(chǎn)大量的體外胚胎，為胚胎工程提供重要依據(jù)；但<2 mm卵泡卵母細(xì)胞的利用價(jià)值不高的原因還需進(jìn)一步從分子的角度繼續(xù)深入研究。

參考文獻(xiàn)：

[1]Choi K H，Joo B S，Sun S T，et al. Administration of visfatin during superovulation improves developmental competency of oocytes and fertility potential in aged female mice[J]. Fertil Steril，2012，97（5）：1234-1241.

[2]Anchamparuthy V M，Dhali A，Lott W M，et al. Vitrification of bovine oocytes：implications of follicular size and sire on the rates of embryonic development[J]. J Assist Reprod Genet，2009，26（11/12）：613-619.

[3]Lequarre A S，Vigneron C，Ribaucour F，et al. Influence of antral follicle size on oocyte characteristics and embryo development in the bovine[J]. Theriogenology，2005，63（3）：841-859.

[4]Crozet N，Ahmed-Ali M，Dubos M P. Developmental competence of goat oocytes from follicles of different size categories following maturation，fertilization and culture in vitro[J]. J Reprod Fertil，1995，103（2）：293-298.

[5]Romaguera R，Casanovas A，Morató R，et al. Effect of follicle diameter on oocyte apoptosis，embryo development and chromosomal ploidy in prepubertal goats[J]. Theriogenology，2010，74（3）：364-373.

[6]田長(zhǎng)永，楊景晁，宋連喜，等. 卵泡直徑對(duì)遼寧絨山羊卵母細(xì)胞體外培養(yǎng)的影響[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī)，2010，37（2）：66-70.

[7]葉華虎，袁菊芳，劉宏偉，等. 不同直徑山羊卵泡卵母細(xì)胞的發(fā)育特征及體外發(fā)育能力[J]. 中國(guó)比較醫(yī)學(xué)雜志，2008，18（10）：32-36.

[8]Clancy K B H，Baerwald A R，Pierson R A. Systemic inflammation is associated with ovarian follicular dynamics during the human menstrual cycle[J]. PLoS One，2013，228（5）：e64807.

[9]Heighington C S，Kipreos E T. Embryogenesis：Degenerate phosphatases control the oocyte-to-embryo transition[J]. Curr Biol，2009，19（20）：939-941.

[10]Anguita B，Paramio M T，Jiménez-Macedo A R，et al. Total RNA and protein content，Cyclin B1 expression and developmental competence of prepubertal goat oocytes[J]. Anim Reprod Sci，2008，103（3/4）：290-303.

[11]Izumi T，Sakakida S，Muranishi Y，et al. Allometric study on the relationship between the growth of ovarian follicles and oocytes in domestic cats[J]. J Reprod Dev，2012，58（4）：484-489.

[12]Hyttel P，F(xiàn)air T，Callesen H，et al. Oocyte growth capacitation and final maturation in cattle[J]. Theriogenology，1997，47（1）：23-32.

[13]Nabenishi H，Ohta H，Nishimoto T，et al. The effects of cysteine addition during in vitro maturation on the developmental competence，ROS，GSH，and apoptosis level of bovine oocytes exposed to heat stress[J]. Zygote，2012，20（3）：249-259.endprint

[14]Abdoon A S，Kandil O M，Zeng S M，et al. Mitochondrial distribution，ATP-GSH contents，calcium[Ca2+]oscillation during in vitro maturation of dromedary camel oocytes[J]. Theriogenology，2011，76（7）：1207-1214.

[15]Feng W G，Sui H S，Han Z B，et al. Effects of follicular atresia and size on the developmental competence of bovine oocytes：a study using the well-in-drop culture system[J]. Theriogenology，2007，67（8）：1339-1350.

[16]Pavlok A，Kanka J，Motlik J，et al. Culture of bovine oocytes from small antral follicles in meiosis-inhibiting medium with butyrolactone Ⅰ：RNA synthesis，nucleolar morphology and meiotic competence[J]. Animal Reproduction Science，2000，64（1/2）：1-11.

[17]Han Z B，Lan G C，Wu Y G，et al. Interactive effects of granulosa cell apoptosis，follicle size，cumulus-oocyte complex morphology，and cumulus expansion on the developmental competence of goat oocytes：a study using the well-in-drop culture system[J]. Reproduction，2006，132（5）：749-758.

[18]Brison D R，Schultz R M. Apoptosis during mouse blastccyst formation：evidence for a role for survival factors including transforming growth factor alpha[J]. Biol Reprod，1997，56（5）：1088-1096.

[19]Bhojwani S，Alm H，Torner H，et al. Selection of developmentally competent oocytes through brilliant cresyl blue stain enhances blastocyst development rate after bovine nuclear transfer[J]. Theriogenology，2007，67（2）：341-345.

[20]Wu Y G，Liu Y，Zhou P，et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining：a study using the mouse model[J]. Cell Research，2007，17（8）：722-731.endprint

[14]Abdoon A S，Kandil O M，Zeng S M，et al. Mitochondrial distribution，ATP-GSH contents，calcium[Ca2+]oscillation during in vitro maturation of dromedary camel oocytes[J]. Theriogenology，2011，76（7）：1207-1214.

[15]Feng W G，Sui H S，Han Z B，et al. Effects of follicular atresia and size on the developmental competence of bovine oocytes：a study using the well-in-drop culture system[J]. Theriogenology，2007，67（8）：1339-1350.

[16]Pavlok A，Kanka J，Motlik J，et al. Culture of bovine oocytes from small antral follicles in meiosis-inhibiting medium with butyrolactone Ⅰ：RNA synthesis，nucleolar morphology and meiotic competence[J]. Animal Reproduction Science，2000，64（1/2）：1-11.

[17]Han Z B，Lan G C，Wu Y G，et al. Interactive effects of granulosa cell apoptosis，follicle size，cumulus-oocyte complex morphology，and cumulus expansion on the developmental competence of goat oocytes：a study using the well-in-drop culture system[J]. Reproduction，2006，132（5）：749-758.

[18]Brison D R，Schultz R M. Apoptosis during mouse blastccyst formation：evidence for a role for survival factors including transforming growth factor alpha[J]. Biol Reprod，1997，56（5）：1088-1096.

[19]Bhojwani S，Alm H，Torner H，et al. Selection of developmentally competent oocytes through brilliant cresyl blue stain enhances blastocyst development rate after bovine nuclear transfer[J]. Theriogenology，2007，67（2）：341-345.

[20]Wu Y G，Liu Y，Zhou P，et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining：a study using the mouse model[J]. Cell Research，2007，17（8）：722-731.endprint

[14]Abdoon A S，Kandil O M，Zeng S M，et al. Mitochondrial distribution，ATP-GSH contents，calcium[Ca2+]oscillation during in vitro maturation of dromedary camel oocytes[J]. Theriogenology，2011，76（7）：1207-1214.

[15]Feng W G，Sui H S，Han Z B，et al. Effects of follicular atresia and size on the developmental competence of bovine oocytes：a study using the well-in-drop culture system[J]. Theriogenology，2007，67（8）：1339-1350.

[16]Pavlok A，Kanka J，Motlik J，et al. Culture of bovine oocytes from small antral follicles in meiosis-inhibiting medium with butyrolactone Ⅰ：RNA synthesis，nucleolar morphology and meiotic competence[J]. Animal Reproduction Science，2000，64（1/2）：1-11.

[17]Han Z B，Lan G C，Wu Y G，et al. Interactive effects of granulosa cell apoptosis，follicle size，cumulus-oocyte complex morphology，and cumulus expansion on the developmental competence of goat oocytes：a study using the well-in-drop culture system[J]. Reproduction，2006，132（5）：749-758.

[18]Brison D R，Schultz R M. Apoptosis during mouse blastccyst formation：evidence for a role for survival factors including transforming growth factor alpha[J]. Biol Reprod，1997，56（5）：1088-1096.

[19]Bhojwani S，Alm H，Torner H，et al. Selection of developmentally competent oocytes through brilliant cresyl blue stain enhances blastocyst development rate after bovine nuclear transfer[J]. Theriogenology，2007，67（2）：341-345.

[20]Wu Y G，Liu Y，Zhou P，et al. Selection of oocytes for in vitro maturation by brilliant cresyl blue staining：a study using the mouse model[J]. Cell Research，2007，17（8）：722-731.endprint