乙蒜素與溴硝醇、代森錳鋅2種農(nóng)藥復(fù)配對(duì)丁香假單胞桿菌的聯(lián)合毒力

王瑞等

摘要：為篩選防治獼猴桃潰瘍病的有效藥劑，采用抑菌圈法，測(cè)定乙蒜素分別與溴硝醇、代森錳鋅 2 種藥劑復(fù)配對(duì)丁香假單胞桿菌的聯(lián)合毒力，并篩選出最佳組配。結(jié)果表明，乙蒜素與溴硝醇以 1 ∶ 5 的比例復(fù)配增效作用最好，EC50為0.001 mg/mL，共毒系數(shù)為214.7，低于農(nóng)用鏈霉素（EC50為0.004 mg/mL）；乙蒜素與與代森錳鋅以1 ∶ 3復(fù)配時(shí)也具有增效作用，EC50為0.005 mg/mL，共毒系數(shù)為205.7。

關(guān)鍵詞：乙蒜素；溴硝醇；代森錳鋅；丁香假單胞桿菌；復(fù)配；增效作用

中圖分類號(hào)： S481+.9 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0071-03

由丁香假單胞桿菌（Pseudomonas syringae pv. actinidia）引起的獼猴桃潰瘍病是一種毀滅性的細(xì)菌性病害。近年來，該病害來勢(shì)兇猛、危害猖獗，常造成獼猴桃果園毀滅，給獼猴桃產(chǎn)業(yè)造成極大的損失。2010年以來，中國、法國、新西蘭、西班牙、土耳其、韓國、意大利等國家種植獼猴桃相繼大規(guī)模暴發(fā)潰瘍病，并確認(rèn)致病菌為丁香假單胞桿菌[1-7]。貴州省修文縣自2008年以來大力發(fā)展獼猴桃種植業(yè)，2011年該縣獼猴桃被國家工商總局核準(zhǔn)為地理標(biāo)志證明商標(biāo)；預(yù)計(jì)到2015年，全縣獼猴桃面積計(jì)劃發(fā)展到2 000 hm2，產(chǎn)量3萬t以上。該病害在修文縣也存在暴發(fā)趨勢(shì)，嚴(yán)重影響了該地區(qū)獼猴桃產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展[8]。目前，國內(nèi)外研究者對(duì)獼猴桃潰瘍病的防治主要集中于農(nóng)業(yè)防治、化學(xué)防治和生物防治3個(gè)方面，其中最有效的方法為化學(xué)防治。但國內(nèi)外對(duì)于該病害的藥劑防治主要依賴于銅制劑和鏈霉素，這些藥劑長期使用和不規(guī)范使用易使病原菌產(chǎn)生抗藥性，導(dǎo)致防治效果下降[9]?；瘜W(xué)藥劑的合理復(fù)配使用不僅可以起到提高防效、擴(kuò)大防治譜的效果，還可達(dá)到有效延緩病原菌抗藥性和降低成本的目的[10]。筆者所在課題組在前期商品藥劑篩選工作中發(fā)現(xiàn)，乙蒜素、溴硝醇、代森錳鋅3種農(nóng)藥在室內(nèi)毒力和田間防治中效果較好。乙蒜素是一種高效、低毒、低殘留的有機(jī)硫廣譜內(nèi)吸性殺菌劑，是中國首創(chuàng)的具有仿生結(jié)構(gòu)的綠色農(nóng)藥，對(duì)水稻、黃瓜、棉花、油菜等作物的稻瘟病、枯萎病、霜霉病、角斑病等病害防治效果良好，且殘留量低[10-11]。溴硝醇是一種溴代硝基醇類廣譜殺菌劑，具有很高的殺菌活性、很低的使用濃度以及較寬的pH值使用范圍，是美國食品藥物管理局（FDA）批準(zhǔn)使用的化妝品防腐劑之一，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中也得到廣泛使用[12]。與上述2種農(nóng)藥相似，代森錳鋅也為一種廣譜、低毒、低殘留、高效、不易產(chǎn)生抗性的保護(hù)性殺菌劑，并已用于獼猴桃潰瘍病的防治[13]。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，將修文縣境內(nèi)獼猴桃植株患處分離、純化并經(jīng)菌落PCR、DNA測(cè)序和比對(duì)，得到潰瘍病致病菌丁香假單胞桿菌。以此為靶標(biāo)，測(cè)定乙蒜素、溴硝醇和代森錳鋅單劑和不同比例復(fù)配藥劑室內(nèi)毒力，從而篩選出最佳活性的組配，為獼猴桃種植業(yè)中潰瘍病的繁殖提供長效、高效藥劑。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

供試藥劑包括80%代森錳鋅可濕性粉劑（美國陶氏益農(nóng)公司）；30%乙蒜素乳油（浙江平湖農(nóng)藥廠）；20%溴硝醇可濕性粉劑（遼寧省丹東市農(nóng)藥總廠）。對(duì)照藥劑為72%硫酸鏈霉素（四川普惠生物工程有限公司）。

1.2 供試菌種

參照方中達(dá)的方法[14]，于2012年3月從貴州省貴陽市修文益眾農(nóng)場(chǎng)發(fā)病植株患處取樣；通過選擇性培養(yǎng)、分離、純化、保存；使用16S rRNA進(jìn)行菌落PCR，得到16S rRNA序列，通過在美國國立生物技術(shù)信息中心（NCBI）基因庫Blast比對(duì)，獲得高同源性序列，根據(jù)搜索的高同源性序列可知目標(biāo)菌種屬于丁香假單胞桿菌屬，從而得到靶標(biāo)。

1.3 供試培養(yǎng)基

NA培養(yǎng)基：牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂18.0 g，經(jīng)蒸餾水定容至1 000 mL，pH值調(diào)為 6.8～7.0，121 ℃濕熱滅菌20 min備用。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 藥劑處理 乙蒜素、溴硝醇、代森錳鋅、乙蒜素 ∶ 溴硝醇（1 ∶ 5、1 ∶ 3、1 ∶ 1、3 ∶ 1、5 ∶ 1）以及乙蒜素 ∶ 代森錳鋅（1 ∶ 5、1 ∶ 3、1 ∶ 1、3 ∶ 1、5 ∶ 1）。單劑和復(fù)配制劑均設(shè)為125、0.625、0.4167、0.3125、0.25、0.2083 mg/mL 等6個(gè)濃度梯度，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，另設(shè)清水為空白對(duì)照，農(nóng)用鏈霉素為對(duì)照。

1.4.2 測(cè)定方法 采用抑菌圈法測(cè)定單劑、復(fù)配劑對(duì)丁香假單胞桿菌的室內(nèi)毒力。用無菌水配置含病原菌細(xì)胞100萬～1 000萬/mL 的菌懸液，每皿加入菌懸液1.5 mL，倒入約 12 mL 冷卻的NA培養(yǎng)基，搖勻后制成平板。將直徑為6 mm的消毒濾紙片放入各藥液內(nèi)浸泡1 h，取出，放入平皿中，以無菌水浸泡濾紙為對(duì)照（CK），置于28 ℃下培養(yǎng)，每處理重復(fù)3次。48 h后觀察，測(cè)量抑菌圈直徑，計(jì)算抑制率[15]，將抑制率換算成抑制概率，以藥劑濃度為橫坐標(biāo)、以抑制概率為縱坐標(biāo)作回歸直線，得到各藥劑對(duì)獼猴桃潰瘍致病菌的毒力回歸方程及抑制中濃度（EC50）。

3 結(jié)論

在前期大量藥劑篩選過程中發(fā)現(xiàn)，乙蒜素、代森錳鋅和溴硝醇對(duì)修文地區(qū)獼猴桃潰瘍病致病菌具有較高的生物活性。本研究從該地區(qū)因長期使用農(nóng)用鏈霉素而產(chǎn)生抗性問題、增加防控藥劑的角度出發(fā)，將乙蒜素、代森錳鋅、溴硝醇進(jìn)行復(fù)配，以農(nóng)用鏈霉素為對(duì)照進(jìn)行室內(nèi)生物活性篩選，結(jié)果表明，乙蒜素與代森錳鋅配比為 1 ∶ 3、乙蒜素與溴硝醇配比為1 ∶ 5對(duì)引起獼猴桃潰瘍病的假單胞桿菌具有較好的生物活性，其EC50分別為0.005、0.001 mg/L，這2種復(fù)配劑共毒系數(shù)分別為205.7、214.7，所得結(jié)果經(jīng)Wadley法[17]進(jìn)一步驗(yàn)證，表現(xiàn)出了明顯的增效作用；而農(nóng)用鏈霉素的EC50為 0.004 mg/mL。從室內(nèi)活性篩選的結(jié)果可知，篩選出的復(fù)配劑對(duì)假單胞桿菌具有優(yōu)異的效果，有望代替硫酸鏈霉素對(duì)獼猴桃潰瘍病的防治。本研究為獼猴桃潰瘍病的田間防治奠定了良好的基礎(chǔ)，可為獼猴桃潰瘍病的大田防治提供參考，進(jìn)一步的田間試驗(yàn)正在進(jìn)行中。

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu Y，Li S J，Zhu T H，et al. Specific DNA markers for detection of bacterial canker of kiwifruit in Sichuan，China[J]. African Journal of Microbiology Research，2012，6（49）：7512-7519.

[2]Vanneste J L，Poliakoff F，Audusseau C，et al. First report of Pseudomonas syringae pv. actinidiae，the causal agent of bacterial canker of kiwifruit in France[J]. Molecular Plant Pathology，2011，95（10）：631-640.

[3]Everett K R，Taylor R K，Romberg M K，et al. First report of Pseudomonas syringae pv. actinidiae causing kiwifruit bacterial canker in New Zealand[J]. Australasian Plant Disease Notes，2011，6（1）：67-71.

[4]Abelleira A，López M M，Pealver J，et al. First report of bacterial canker of kiwifruit caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Spain[J]. Molecular Plant Pathology，2011，95（12）：631-640.

[5]Bastas K K，Karakaya A. First report of bacterial canker of kiwifruit caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Turkey[J]. Molecular Plant Pathology，2012，96（3）：631-640.

[6]Koh Y J，Kim G H，Jung J S，et al. Outbreak of bacterial canker on Hort16A（Actinidia chinensis Planchon）caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Korea[J]. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science，2010，38（4）：275-282.

[7]Vanneste J L，Yu J，Cornish D A. Molecular characterisations of Pseudomonas syringae pv. actinidiae strains isolated from the recent outbreak of bacterial canker on kiwifruit in Italy[J]. New Zealand Plant Protection，2010，63：7-14.

[8]龍友華，夏錦書. 獼猴桃潰瘍病防治藥劑室內(nèi)篩選及田間藥效試驗(yàn)[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（10）：84-86.

[9]高小寧，趙志博，黃其玲，等. 獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病研究進(jìn)展[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2012，29（2）：262-268.

[10]吳乾守. 兩種乙蒜素復(fù)配劑防治水稻稻瘟病的田間應(yīng)用研究[J]. 福建稻麥科技，2007，25（2）：17-18.

[11]王海萍，楊仁斌，佘佳榮，等. 稻田水、土壤和稻米中乙蒜素的殘留[J]. 農(nóng)藥，2009，48（3）：206-207.

[12]李 興，常宏宏，魏文瓏. 抗菌劑溴硝醇的合成及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 日用化學(xué)品科學(xué)，2010，33（10）：23-25.

[13]王永蘭，杜永章，施正偉. 獼猴桃潰瘍病發(fā)生特點(diǎn)及綜合防治技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（23）：188，192.

[14]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：179-189.

[15]孫廣宇，宗兆鋒. 植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：142-143.

[16]Sun Y P，Johnson E R. Analysis of joint action of insecticides against house flies[J]. Journal of Economic Entomology，1960，53（5）：887-892.

[17]Wadly F M. Experimental studies in entomology[M]. Washington：Graduate School Press，1976：133.

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu Y，Li S J，Zhu T H，et al. Specific DNA markers for detection of bacterial canker of kiwifruit in Sichuan，China[J]. African Journal of Microbiology Research，2012，6（49）：7512-7519.

[2]Vanneste J L，Poliakoff F，Audusseau C，et al. First report of Pseudomonas syringae pv. actinidiae，the causal agent of bacterial canker of kiwifruit in France[J]. Molecular Plant Pathology，2011，95（10）：631-640.

[3]Everett K R，Taylor R K，Romberg M K，et al. First report of Pseudomonas syringae pv. actinidiae causing kiwifruit bacterial canker in New Zealand[J]. Australasian Plant Disease Notes，2011，6（1）：67-71.

[4]Abelleira A，López M M，Pealver J，et al. First report of bacterial canker of kiwifruit caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Spain[J]. Molecular Plant Pathology，2011，95（12）：631-640.

[5]Bastas K K，Karakaya A. First report of bacterial canker of kiwifruit caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Turkey[J]. Molecular Plant Pathology，2012，96（3）：631-640.

[6]Koh Y J，Kim G H，Jung J S，et al. Outbreak of bacterial canker on Hort16A（Actinidia chinensis Planchon）caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Korea[J]. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science，2010，38（4）：275-282.

[7]Vanneste J L，Yu J，Cornish D A. Molecular characterisations of Pseudomonas syringae pv. actinidiae strains isolated from the recent outbreak of bacterial canker on kiwifruit in Italy[J]. New Zealand Plant Protection，2010，63：7-14.

[8]龍友華，夏錦書. 獼猴桃潰瘍病防治藥劑室內(nèi)篩選及田間藥效試驗(yàn)[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（10）：84-86.

[9]高小寧，趙志博，黃其玲，等. 獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病研究進(jìn)展[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2012，29（2）：262-268.

[10]吳乾守. 兩種乙蒜素復(fù)配劑防治水稻稻瘟病的田間應(yīng)用研究[J]. 福建稻麥科技，2007，25（2）：17-18.

[11]王海萍，楊仁斌，佘佳榮，等. 稻田水、土壤和稻米中乙蒜素的殘留[J]. 農(nóng)藥，2009，48（3）：206-207.

[12]李 興，常宏宏，魏文瓏. 抗菌劑溴硝醇的合成及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 日用化學(xué)品科學(xué)，2010，33（10）：23-25.

[13]王永蘭，杜永章，施正偉. 獼猴桃潰瘍病發(fā)生特點(diǎn)及綜合防治技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（23）：188，192.

[14]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：179-189.

[15]孫廣宇，宗兆鋒. 植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：142-143.

[16]Sun Y P，Johnson E R. Analysis of joint action of insecticides against house flies[J]. Journal of Economic Entomology，1960，53（5）：887-892.

[17]Wadly F M. Experimental studies in entomology[M]. Washington：Graduate School Press，1976：133.

參考文獻(xiàn)：

[1]Liu Y，Li S J，Zhu T H，et al. Specific DNA markers for detection of bacterial canker of kiwifruit in Sichuan，China[J]. African Journal of Microbiology Research，2012，6（49）：7512-7519.

[2]Vanneste J L，Poliakoff F，Audusseau C，et al. First report of Pseudomonas syringae pv. actinidiae，the causal agent of bacterial canker of kiwifruit in France[J]. Molecular Plant Pathology，2011，95（10）：631-640.

[3]Everett K R，Taylor R K，Romberg M K，et al. First report of Pseudomonas syringae pv. actinidiae causing kiwifruit bacterial canker in New Zealand[J]. Australasian Plant Disease Notes，2011，6（1）：67-71.

[4]Abelleira A，López M M，Pealver J，et al. First report of bacterial canker of kiwifruit caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Spain[J]. Molecular Plant Pathology，2011，95（12）：631-640.

[5]Bastas K K，Karakaya A. First report of bacterial canker of kiwifruit caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Turkey[J]. Molecular Plant Pathology，2012，96（3）：631-640.

[6]Koh Y J，Kim G H，Jung J S，et al. Outbreak of bacterial canker on Hort16A（Actinidia chinensis Planchon）caused by Pseudomonas syringae pv. actinidiae in Korea[J]. New Zealand Journal of Crop and Horticultural Science，2010，38（4）：275-282.

[7]Vanneste J L，Yu J，Cornish D A. Molecular characterisations of Pseudomonas syringae pv. actinidiae strains isolated from the recent outbreak of bacterial canker on kiwifruit in Italy[J]. New Zealand Plant Protection，2010，63：7-14.

[8]龍友華，夏錦書. 獼猴桃潰瘍病防治藥劑室內(nèi)篩選及田間藥效試驗(yàn)[J]. 貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2010，38（10）：84-86.

[9]高小寧，趙志博，黃其玲，等. 獼猴桃細(xì)菌性潰瘍病研究進(jìn)展[J]. 果樹學(xué)報(bào)，2012，29（2）：262-268.

[10]吳乾守. 兩種乙蒜素復(fù)配劑防治水稻稻瘟病的田間應(yīng)用研究[J]. 福建稻麥科技，2007，25（2）：17-18.

[11]王海萍，楊仁斌，佘佳榮，等. 稻田水、土壤和稻米中乙蒜素的殘留[J]. 農(nóng)藥，2009，48（3）：206-207.

[12]李 興，常宏宏，魏文瓏. 抗菌劑溴硝醇的合成及應(yīng)用研究進(jìn)展[J]. 日用化學(xué)品科學(xué)，2010，33（10）：23-25.

[13]王永蘭，杜永章，施正偉. 獼猴桃潰瘍病發(fā)生特點(diǎn)及綜合防治技術(shù)[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，2009（23）：188，192.

[14]方中達(dá). 植病研究方法[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1996：179-189.

[15]孫廣宇，宗兆鋒. 植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002：142-143.

[16]Sun Y P，Johnson E R. Analysis of joint action of insecticides against house flies[J]. Journal of Economic Entomology，1960，53（5）：887-892.

[17]Wadly F M. Experimental studies in entomology[M]. Washington：Graduate School Press，1976：133.