血管內皮生長因子-β在人絨毛膜癌中的作用研究

伍彩雯 楊 采蓮 王 永榮 高新明

絨毛膜癌其病理成分主要為合體滋養(yǎng)細胞和細胞滋養(yǎng)細胞，屬于惡性程度極高的腫瘤，缺少絨毛組織，極易出現(xiàn)早期轉移，特別是早期肺部轉移，化療對該病具有良好的作用，但是在長期的化療過程中患者會出現(xiàn)嚴重的副反應和腦轉移等情況，因而病死率較高［1，2］。血管內皮生長因子-β(VEGF-β) 即血管內皮生長因子-B，屬于血管內皮生長因子家族，可通過與樣酪氨酸激酶-1的結合而發(fā)生作用。研究認為VEGF-β可通過影響內皮型一氧化氮合酶(eNOS)來介導腫瘤新生［3］。有關研究指出VEGF-β主要在胰腺癌、乳腺癌、結腸直腸癌等惡性腫瘤的邊緣呈現(xiàn)高表達，而在正常人血漿中只有少量表達，因此VEGF-β與腫瘤細胞的侵襲力密切相關［3］。但是目前相關的研究和報道并不多見，本文以人絨毛膜癌株JAR和JEG-3為模型，觀察VEGF-β mRNA的表達與人絨毛膜癌的關系，為臨床基因治療絨毛膜癌轉移提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料來源 細胞株:JAR來自于中國科學院上海細胞所，JEG-3來自于中國科學院動物研究所計劃生育及生殖生物學國家重點實驗室。

1.2 試劑 Falcon公司的15 ml和10 ml一次性離心管和一次性移液管、6well細胞培養(yǎng)板、25 cm2一次性細胞培養(yǎng)瓶;Eppendorf公司的1.5 ml eppendorf管和9600PCR管;TaKara公司的25 mmol/L MgCl2和10*PCR buffer及10 mmol/L dNTP Mix;上海生物工程技術服務有限公司的Taq DNA Polymerase;SABC公司的DNA分子量標準入DNA/Hindl;Takara公司的DNAMarkerDL2000及RT-PCR試劑盒;promega公司的Reverse Transcription system Kit、溴化乙錠(EB);Invitrogen公司的lipofeetamineTM2000;Sigma公司的焦碳酸二乙酉旨(DEPC)、普通瓊脂糖(agarose);天津瀕洋生物制品有限公司的苯酚;湖南師范大學化學試劑廠的無水乙醇、三氯甲烷、異丙醇;Gibco BRL公司的Trizol;Difco公司的胰酶;GIBCO公司的RPMI-1640細胞培養(yǎng)基;杭州四季青生物技術公司的小牛血清;Coming Costar公司的Transwell侵襲小室(24孔板，濾膜孔徑8 μm);北京大學細胞生物學系Matrigel凝膠(3.5 μg/μl);invitrogen 公司的陽離子脂質體轉染試劑LipofectamineTM2000;武漢晶賽生物工程技術有限公司的針對人VEGF-β基因的靶向shRNA及Fermentas公司的25 mmol/L MgCl2、10 mmol/L dNTP Mix、Taq DNA Polymerase［4，5］。儀器包括制冰機、PCR 儀、Gel Doc1000凝膠成像分析系統(tǒng)、微量加樣器、電動移液器、－80℃冰箱、高速離心機、微波爐等。晶賽公司以VEGF-β為靶基因涉及的DNA兩條序列，以轉染的shRNA為陰性對照組，反義序列:5’-AAAGGACAGUGCUGUGAAGCCAGACAA-3’正 義 序 列:5’-AAUUUCCUGUCACGACACUUCGGUCUG-3’PCR 擴增引物序列見表1。

表1 PCR擴增引物序列

1.3 方法 將兩種細胞分別在飽和濕度、溫度37℃、95%空氣和5%CO2的培養(yǎng)環(huán)境中于10%小牛血清RPMI-1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)，培養(yǎng)液1～2 d更換1次，細胞繁殖近瓶底70%～80%時傳代1次。

1.4 統(tǒng)計學分析 應用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種細胞侵襲力差異 在進行Matrigel體外侵襲力的實驗中，細胞侵襲力通過Transwell膜的透過情況來衡量，研究結果顯示JAR細胞零散分布于Transwell膜，且數(shù)量較少，而JEG-3細胞穿過Transwell膜的數(shù)量較多，分布較為密集，經比較兩者差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表2。

表2 兩種細胞侵襲力比較±s

表2 兩種細胞侵襲力比較±s

組別 透膜數(shù) 試驗次數(shù) t值 P值JAR 105 ±15 5 12.729 ＜0.05 JEG-3 218±13 5

2.2 JAR、JEG-3中VEGF-β mRNA 差異的PT-PCR 檢測 研究合成VEGF-β引物，經圖像分析系統(tǒng)分析，計算GAPDH和VEGF-β的光密度值，結果顯示JEG-3細胞內VEGF-β mRNA明顯高于JAR細胞，差別有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)。見表3。

表3 JAR、JEG-3中VEGF-β mRNA差異的PT-PCR檢測±s

表3 JAR、JEG-3中VEGF-β mRNA差異的PT-PCR檢測±s

組別 VEGF-β mRNA 試驗次數(shù) t值 P值JAR 0.472 ±0.04 5 31.3 ＜0.05 JEG-3 1.724 ±0.08 5

2.3 轉染后3組細胞內VEGF-β mRNA情況 研究顯示轉染shRNA在JEG-3的細胞抑制方面具有明顯的作用，與對照組和非特異性shRNA相比，差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，對照組與非特異組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P ＞0.05)。見表4。

表4 轉染后各組細胞內VEGF-β mRNA情況±s

表4 轉染后各組細胞內VEGF-β mRNA情況±s

注:與試驗組比較，*P ＜0.05

組別 VEGF-β mRNA 灰度值 試驗次數(shù)試驗組(shRNA)0.43 ±0.04 5對照組(空白對照) 1.68 ±0.08* 5非特異 shRNA 組 1.68 ±0.09*5

2.4 轉染后3組侵襲力差異 以Matrigel體外侵襲實驗獲得的Transwell膜細胞數(shù)來反應侵襲力強弱，研究顯示，試驗組較對照組和非特異組穿膜數(shù)量明顯減少，差異有統(tǒng)計學差異(P ＜0.05)。見表5。

表5 轉染后各組侵襲力差異±s

表5 轉染后各組侵襲力差異±s

注:與試驗組比較，*P ＜0.05

組別 穿膜細胞數(shù) 試驗次數(shù)試驗組(shRNA)106±9 5對照組(空白對照) 223±11* 5非特異組shRNA組 215±13*5

3 討論

人類滋養(yǎng)細胞與體細胞的特殊細胞不同，它具有特殊的生物學特性和繁殖特點，正常妊娠的滋養(yǎng)細胞受時間和空間的調控呈現(xiàn)一定的侵襲力，而當發(fā)生妊娠滋養(yǎng)細胞瘤時，此時滋養(yǎng)細胞則失去時間和空間的控制，特別是絨毛膜癌，侵襲轉移和播散的能力特別強。目前研究認為，正常的滋養(yǎng)細胞侵襲對維持妊娠順利進行具有重要作用，但是當侵襲不收控制時，將會導致一些列婦科妊娠相關疾病，嚴重者危及患者生命［6，7］。目前由于化療過程中出現(xiàn)的副反應和腦轉移嚴重制約了該疾病的治療，因此降低絨毛膜癌的侵襲力，控制和防止其轉移能力則成為臨床醫(yī)學界的一大難題，本研究經過試驗證明JEG-3的侵襲力遠遠高于JAR細胞，且差異有統(tǒng)計學意義(P ＜0.05)，這提示VEGF-β有可能是絨毛膜癌侵襲的重要因子，這與相關研究相似，而有研究認為VEGF-β會通過促進癌細胞增殖、增加瘤供血能力和運動能力及癌細胞基底膜穿透能力來參與絨毛膜癌的侵襲和轉移過程，shRNA則對 JEG-3的侵襲起到了抑制的作用［7］?？傊?，VEGF-β可以增加人絨毛膜癌的侵襲力，而VEGF-β shRNA則對其侵襲力起到了一定的抑制作用，因此在人絨毛膜癌的治療中VEGF-β的治療，將成為該病新的治療方式。

1 段娥，王芳，李英勇.1α，25-二羥基維生素D3對絨毛膜癌細胞株JAR的影響及其機制.現(xiàn)代婦產科進展，2011，20:614-617.

2 胡惠，劉惠寧，何可人，等.血管內皮生長因子B在絨毛膜癌侵襲中的作用.中華婦產科雜志，2010，45:148-150.

3 石慧敏.原發(fā)性輸卵管絨毛膜癌誤診為輸卵管妊娠1例.實用婦產科雜志，2011，27:463.

4 舒珊榮，柯佩琪，楊越波，等.絨毛膜癌腦轉移8例臨床分析.實用婦產科雜志，2010，26:944-946.

5 王慧敏，唐均英.原發(fā)性輸卵管絨毛膜癌1例并文獻回顧.四川醫(yī)學，2013，34:783-784.

6 徐小燕，龐義存.絨毛膜癌肺轉移并發(fā)呼吸衰竭2例及文獻復習.河北醫(yī)科大學學報，2013，34:476-479.

7 張卓，李玉紅，許倩.不同劑量IL-12對絨毛膜癌JEG-3細胞增殖的影響.臨床和實驗醫(yī)學雜志，2011，10:161-162，164.