川中黑山羊BMP2、BMP4基因cDNA克隆及生物信息學(xué)分析

龍石太等

摘要：參照GenBank已公布的綿羊BMP2基因序列與牛BMP4基因序列分別設(shè)計(jì)一對(duì)引物，以川中黑山羊卵巢總RNA為模板，采用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增川中黑山羊BMP2基因和BMP4基因的cDNA序列并進(jìn)行克隆、測(cè)序及相關(guān)生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明，川中黑山羊BMP2基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 188 bp（GenBank登錄號(hào)為KF492982），BMP4基因編碼區(qū)全長(zhǎng)為1 230 bp（GenBank登錄號(hào)為KF492983），分別編碼395、409個(gè)氨基酸。川中黑山羊與綿羊、牛、豬、人、馬、鼠、雞BMP2基因編碼區(qū)序列的同源性分別為99.7%、98.7%、92.0%、89.6%、91.4%、86.1%、78.9%；川中黑山羊與綿羊、牛、豬、人、馬、鼠、雞BMP4基因編碼區(qū)序列的同源性分別為99.3%、99.1%、95.9%、95.2%、94.4%、920%、80.1%。用MEGA 4.0構(gòu)建物種間分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示，BMP2基因和BMP4基因的聚類反應(yīng)基本一致，川中黑山羊首先與綿羊聚類，再分別與牛、豬、馬、人和鼠聚類，最后與雞聚類，這與動(dòng)物分類學(xué)基本吻合。

關(guān)鍵詞：川中黑山羊；BMP2基因；BMP4基因；克?。簧镄畔W(xué)

中圖分類號(hào)：S827.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）03-0019-04

骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）超家族中最大的亞族，是Urist等于1965年從脫鈣骨基質(zhì)中分離得到的一種有活性的蛋白質(zhì)，并利用該蛋白質(zhì)成功誘導(dǎo)了異位成骨[1]，所以命名為骨形態(tài)發(fā)生蛋白。許多研究表明，BMPs不僅能誘導(dǎo)骨及軟骨的形成、分化，而且能影響脊椎動(dòng)物的神經(jīng)細(xì)胞、造血組織、眼睛、腎和上皮附屬器官的形成、器官發(fā)生以及組織定型與重塑等[2]。BMPs在動(dòng)物大部分組織中均有表達(dá)，在機(jī)體的許多生命活動(dòng)中發(fā)揮作用，所以關(guān)于BMPs的研究越來(lái)越受到重視。有研究發(fā)現(xiàn)，BMPs與雌性動(dòng)物的繁殖機(jī)能相關(guān)，通過旁分泌/自分泌調(diào)節(jié)作用對(duì)卵巢進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育[3-4]。也有研究表明，BMP4可以促進(jìn)小鼠原始卵泡的形成及原始卵泡發(fā)育為初級(jí)卵泡[5]。BMP2、BMP4、BMP6 和BMP7 蛋白可抑制綿羊顆粒細(xì)胞分泌孕酮，但不會(huì)影響綿羊顆粒細(xì)胞增殖和存活[6]，BMP2蛋白可抑制雌二醇與孕酮的合成及cAMP的釋放[7]，BMP4蛋白可抑制綿羊垂體細(xì)胞FSH釋放[8]，由此推測(cè)，BMP2與BMP4可能是多羔動(dòng)物的黃體抑制劑。BMPs還與早期胚胎的細(xì)胞凋亡與增殖密切相關(guān)，對(duì)細(xì)胞分化與器官發(fā)生、發(fā)育具有重要意義，BMP2、BMP4位點(diǎn)的丟失均可導(dǎo)致動(dòng)物胚胎性死亡[9-10]，是胚胎發(fā)育過程中必不可少的信號(hào)分子[11-12]。

川中黑山羊是經(jīng)過長(zhǎng)期自然選擇和人工重點(diǎn)培育而成的多胎山羊品種，它具有性成熟早（母羊初情期為3～4月齡，初配年齡為5～6月齡）、產(chǎn)仔率高（平均產(chǎn)羔率為270%）、生長(zhǎng)速度快、產(chǎn)肉性能好、耐粗食、抗病力強(qiáng)、適應(yīng)性良好等優(yōu)點(diǎn)。為進(jìn)一步闡明川中黑山羊多胎的分子生物學(xué)基礎(chǔ)，本研究克隆了川中黑山羊BMP2、BMP4基因完整編碼區(qū)，與 GenBank 已公布的其他物種進(jìn)行序列比對(duì)，并在此基礎(chǔ)上構(gòu)建物種間分子系統(tǒng)進(jìn)化樹。到目前為止，有關(guān)山羊BMP2與BMP4在生物信息學(xué)方面的研究尚未見報(bào)道，所以本研究采用生物信息學(xué)方法分析這2個(gè)基因及其氨基酸序列的理化性質(zhì)、結(jié)構(gòu)特征等，旨在為進(jìn)一步開展川中黑山羊BMP2、BMP4基因的結(jié)構(gòu)功能、遺傳變異、表達(dá)調(diào)控以及繁殖性狀的相關(guān)分析等研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

在四川省樂至縣天龍科技示范園選取6只3～5歲的健康川中黑山羊，在其發(fā)情后12～24 h（發(fā)情期中期）屠宰，立即采集卵巢等組織，迅速在室溫下的生理鹽水中沖洗3次，置于盛有RNA later的EP管中，迅速投入到液氮中保存，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于超低溫冰箱（-80 ℃）中備用。

1.2 試劑和載體

川中黑山羊組織總RNA提取試劑盒、2×Taq PCR MasterMix、感受態(tài)細(xì)胞均購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自Fermentas（MBI）公司，X-Gal、IPTG、氨芐青霉素、克隆載體PMD-19 Vector購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司，DNA膠回收試劑盒購(gòu)自愛思進(jìn)生物技術(shù)（杭州）有限公司。

1.3 卵巢總RNA的提取

用動(dòng)物組織總RNA提取試劑盒（離心柱型）提取川中黑山羊卵巢總RNA。

1.4 cDNA第一鏈的合成

用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA第一鏈合成。

1.5 引物設(shè)計(jì)及PCR擴(kuò)增目的基因

參照綿羊BMP2基因（GenBank登錄號(hào)XM_004014353）設(shè)計(jì)1對(duì)引物（F：5′-AGAAGGAAGAGGCGAAGGAAGG-3′，R：5′-TGCTGTGCTAACGACACCCAC-3′），擴(kuò)增片段全長(zhǎng)1 331 bp。參照牛的BMP4基因（GenBank登錄號(hào)為NM_001045877）的mRNA序列，用軟件Primer Premier 5設(shè)計(jì)1對(duì)引物（F：5′-ATGATTCCTGGTAACCGAATGC-3′，R：5′-AGGGATGTGGTTGCCGCTGA-3′），擴(kuò)增片段全長(zhǎng) 1 230 bp。引物序列送往上海英俊生物工程有限公司合成。

以合成的卵巢cDNA第一鏈為模板，擴(kuò)增BMP2、BMP4基因，PCR擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性40 s，58 ℃ 退火40 s（BMP2）/62 ℃退火40 s（BMP4），72 ℃延伸 80 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。產(chǎn)物用 15 g/L 瓊脂糖凝膠電泳，再用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)、拍照。

1.6 克隆及重組子篩選和鑒定

PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后，按DNA膠回收試劑盒說(shuō)明進(jìn)行膠回收，回收產(chǎn)物與PMD-19載體連接，置于金屬浴中16 ℃過夜。連接反應(yīng)產(chǎn)物轉(zhuǎn)化宿主菌5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于含氨芐青霉素、X-Gal和IPTG的LB固體平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜。挑選白色單克隆菌落于LB液體培養(yǎng)基中37 ℃振蕩培養(yǎng)12 h，取菌液作PCR進(jìn)行陽(yáng)性重組子鑒定，并提取重組質(zhì)粒。

1.7 生物信息學(xué)分析

1.7.1 核酸序列分析 測(cè)序完成后獲得上下游序列，利用DNAman軟件進(jìn)行序列拼接，并根據(jù)測(cè)序峰圖調(diào)整。從NCBI上查找相關(guān)物種的BMP2、BMP4基因序列，保存?zhèn)溆?。用NCBI在線程序（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）查找ORF，確定CDS區(qū)，并將CDS區(qū)翻譯成氨基酸序列。

1.7.2 蛋白質(zhì)序列分析 用ProtParam程序（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)及其理化參數(shù)（分子量、等電點(diǎn)、分子式等）；用ProtScal程序（http：//expasy.org/tools/protscale.html）分析疏水性；用TMHMM Server v2.0程序（http：//genome.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進(jìn)行跨膜區(qū)預(yù)測(cè)；用SignalP 4.0 Server程序（http：//genome.cbs.D tu.dk/ser-vices/SignalP/）預(yù)測(cè)信號(hào)肽；用PSORT程序（http：//psort.hgc.jp/form.html）預(yù)測(cè)亞細(xì)胞定位；用GOR程序（http：//npsa- pbil.ibcp.fr/cgibin/npsa automat.pl？ page =npsa_ gor4.html）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；用Phyre2程序（http：//www.sbg.bio.ic.ac. uk/phyre2/html/page.cgi？id =index）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)。

2 結(jié)果與分析

2.1 川中黑山羊總RNA提取

從提取的RNA中取4 μL進(jìn)行RNA純度和完整性的檢測(cè)。用1.5%瓊脂糖凝膠在150 V下電泳15 min，結(jié)果如圖1所示。圖1顯示，28S和18S RNA均比較完整，條帶明亮，說(shuō)明所提取的總RNA是完整的，可用于下一步試驗(yàn)。

2.2 PCR擴(kuò)增結(jié)果

吸取PCR產(chǎn)物各4 μL，對(duì)其進(jìn)行電泳檢測(cè)。用1%瓊脂

糖凝 膠電泳檢測(cè)條帶，結(jié)果如圖2所示，其中BMP2基因的目的條帶與預(yù)期大小1 331 bp基本一致，BMP4基因的目的條帶與預(yù)期大小1 230 bp基本一致，且目的條帶明亮，可以進(jìn)行下一步膠回收試驗(yàn)。

2.3 川中黑山羊BMP2、BMP4基因CDS區(qū)的核苷酸序列及其特征

用DNAman軟件對(duì)測(cè)序所得序列進(jìn)行序列比對(duì)、拼接，去除載體序列后，得到BMP2基因1 331 bp，BMP4基因 1 230 bp，與預(yù)期一致。用NCBI ORF Finder查找其開放性閱讀框，并翻譯出氨基酸序列。將川中黑山羊BMP2、BMP4基因序列提交給GenBank，登錄號(hào)分別為KF492982、KF492983。

通過DNAman分析川中黑山羊與其他物種BMP2、BMP4基因CDS區(qū)的核苷酸序列同源性，結(jié)果顯示，川中黑山羊BMP2基因的CDS區(qū)核苷酸序列與綿羊（XM_004014353）、牛（NM_001099141）、豬（NM_001195399）、人（NM_001200）、馬（XM_514508）、鼠（NM_007553）和雞（NM_204358）相應(yīng)序列間的一致性分別為99.7%、98.7%、92.0%、89.6%、91.4%、86.1%、78.9%；川中黑山羊BMP4基因的CDS區(qū)核苷酸序列與綿羊（NM_001110277）、牛（NM_0 01045877）、豬（NM_001101031）、人（NM_130850）、馬（XM_003314330）和鼠（NM_007554）相應(yīng)序列間的一致性分別為99.3%、99.1%、959%、95.2%、94.4%、92.0%、80.1%。說(shuō)明在不同物種間這2個(gè)基因具有較高的一致性，屬于較保守的基因之一。

利用DNAman、ClustalX、MEGA 4.0對(duì)相應(yīng)物種的BMP2、BMP4基因編碼區(qū)進(jìn)行多序列一致性比對(duì)，計(jì)算出遺傳距離，并構(gòu)建基因Neighbor-Joining（NJ）系統(tǒng)發(fā)生樹（圖3、圖4）。從圖3、圖4可以看出，川中黑山羊與綿羊親緣關(guān)系最近，其次是牛，與雞的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)，這與遺傳距離和核苷酸同源性比對(duì)的結(jié)果一致。

2.4 川中黑山羊BMP2、BMP4蛋白的結(jié)構(gòu)特征

Prot Param分析結(jié)果表明，川中黑山羊BMP2、BMP4蛋白的分子式分別為C1974H3097N581O568S16、C2050H3214N616O598S16，相對(duì)分子質(zhì)量分別為44 569.8、46 570.8，理論等電點(diǎn)PI分別為8.96、8.11，半衰期都為30 h，不穩(wěn)定參數(shù)分別為54.83、5754，二者均屬不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)依次為79.49、80.05，疏水性平均數(shù)依次為-0.423、-0.545，預(yù)測(cè)BMP2、BMP4蛋白均為親水性蛋白。結(jié)合ProScale程序分析結(jié)果可知，川中黑山羊BMP2蛋白共有9個(gè)高親水區(qū)，BMP4蛋白有10個(gè)高親水區(qū)，這是蛋白進(jìn)化中氨基酸插入的主要位點(diǎn)。而在這2個(gè)蛋白的N段都存在明顯的疏水區(qū)，可能是信號(hào)肽。通過SignalP 3.0服務(wù)器進(jìn)行信號(hào)肽預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示，在BMP2基因編碼的氨基酸序列第23～24（甘氨酸-亮氨酸）位點(diǎn)可能存在信號(hào)肽位點(diǎn)，該多肽N端存在信號(hào)肽的概率為0.837；BMP4多肽N端存在信號(hào)肽的概率為0.793，信號(hào)肽位點(diǎn)可能位于第24位點(diǎn)與第25位點(diǎn)（丙氨酸至絲氨酸）之間，二者屬分泌型蛋白。

通過在線程序TMHMM 2.0進(jìn)行跨膜區(qū)分析，BMP2和BMP4 都只存在1個(gè)跨膜區(qū)，且跨膜區(qū)都位于信號(hào)肽位置，結(jié)合對(duì)信號(hào)肽的考慮可知，這2個(gè)基因編碼的成熟肽都沒有跨膜區(qū)。TargetP亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，BMP2成熟蛋白位于細(xì)胞外的概率是0.728，BMP4蛋白位于細(xì)胞外的概率是0785。

用GOR程序在線預(yù)測(cè)BMP2蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，該蛋白包括α螺旋（127個(gè)AA殘基）、β折疊（86個(gè)AA殘基）、無(wú)規(guī)卷曲（182個(gè)AA殘基）3種模塊，分別占靶蛋白的32.15%、21.77%、46.08%。BMP4蛋白的α螺旋（127個(gè)AA殘基）、β折疊（74個(gè)AA殘基）、無(wú)規(guī)卷曲（208個(gè)AA殘基）分別占靶蛋白的31.05%、18.09%、50.86%。

通過Phyre 2.0預(yù)測(cè)BMP2和BMP4的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖5和圖6），得到BMP2靶標(biāo)蛋白，其殘基建模覆蓋率81%（320個(gè)氨基酸殘基）；BMP4靶蛋白，其殘基建模覆蓋率為79%（324個(gè)氨基酸殘基），置信度達(dá)100%，說(shuō)明靶標(biāo)蛋白與模板蛋白的空間結(jié)構(gòu)很接近，適合的空間結(jié)構(gòu)比例很大，空間保真性很高，川中黑山羊BMP2和BMP4蛋白多處氨基酸位點(diǎn)具有較高的能量，處于不穩(wěn)定狀態(tài)，說(shuō)明二者為不穩(wěn)定蛋白。

3 討論

3.1 序列比對(duì)

本研究利用PCR技術(shù)從川中黑山羊卵巢組織中克隆得到川中黑山羊BMP2、BMP4基因的cDNA序列，包含了長(zhǎng)度為 1 188、1 230 bp的完整編碼區(qū)，分別編碼395、409個(gè)氨基酸。經(jīng)同源性比對(duì)可知，所得序列與綿羊BMP2、BMP4基因的cDNA序列一致性分別達(dá)到99.7%、99.3%，因此可確定克隆所得序列為川中黑山羊BMP2、BMP4基因cDNA序列。與其他物種進(jìn)行核苷酸序列間的同源性比對(duì)，結(jié)果表明，川中黑山羊的BMP2、BMP4基因編碼區(qū)序列與其他物種同源性很高，基因序列較保守，相對(duì)而言，BMP4基因的保守性比BMP2基因更強(qiáng)。DNAman比對(duì)結(jié)果顯示，BMP2基因編碼區(qū)存在種屬間特異插入或缺失，人的BMP2基因編碼區(qū)長(zhǎng)度為 1 191 bp，比川中黑山羊和牛多 3 bp，編碼396個(gè)氨基酸；而鼠的BMP2基因編碼區(qū)長(zhǎng)為1 185 bp，比川中黑山羊和牛少 3 bp，編碼394個(gè)氨基酸。不同物種間BMP4基因編碼區(qū)也有差異，人和鼠比川中黑山羊和牛少 3 bp。不同組織來(lái)源也可能存在蛋白質(zhì)前體長(zhǎng)度的差異，如骨肉瘤表達(dá)的BMP4前體蛋白為408個(gè)氨基酸，而成熟胎盤組織中表達(dá)的BMP4前體蛋白為402個(gè)氨基酸[13]。

3.2 分子系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系

川中黑山羊與綿羊、牛、人、鼠、雞等物種間BMP2基因構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹結(jié)果表明，川中黑山羊首先與綿羊聚為一類，再分別與牛、豬、馬、人、鼠聚類，最后與雞聚類，各分支置信度均在90%以上，聚類結(jié)果置信度高。由BMP4基因構(gòu)建的分子系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，川中黑山羊與綿羊、牛始終聚為一支，再依次與豬、人、馬、鼠、雞聚類。牛和綿羊以及豬和人在聚類時(shí)置信度分別為73%和78%，導(dǎo)致置信度偏低的原因在于BMP4在聚類物種間核苷酸同源性差異很小，川中黑山羊與綿羊和牛的BMP4基因核苷酸同源性分別為99.3%和99.1%。由此可以看出，BMP2基因更適用于構(gòu)建物種間分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，該分子系統(tǒng)進(jìn)化樹較準(zhǔn)確、真實(shí)地反映了各物種間的進(jìn)化關(guān)系和親緣關(guān)系，即親緣關(guān)系越近的物種，同源性越高，遺傳距離越小。

3.3 結(jié)構(gòu)與功能

川中黑山羊的BMP4基因位于第14號(hào)染色體長(zhǎng)臂2區(qū) 2～3 帶之間，由5個(gè)外顯子、4個(gè)內(nèi)含子組成，其 cDNA 編碼區(qū)全長(zhǎng)均1 230 bp，編碼 409 個(gè)氨基酸，成熟肽為116 個(gè)氨基酸殘基[14]。人的BMP2基因定位于第20號(hào)染色體短臂1區(qū)2帶上，由3個(gè)外顯子、2個(gè)內(nèi)含子組成[15]，編碼區(qū)全長(zhǎng) 1 191 bp，編碼396個(gè)氨基酸殘基的多肽，其成熟肽基因?yàn)?339 bp，成熟肽包括113個(gè)氨基酸分子[16]。分析BMP2、BMP4基因的cDNA序列后發(fā)現(xiàn)，成熟肽基因序列均在3′端編碼區(qū)內(nèi)[17]，同源性比對(duì)結(jié)果也表明，3′端是BMPs的保守區(qū)。

BMP2與BMP4作為TGF-β家族的重要成員，且屬于同一亞族，具有分泌型蛋白質(zhì)的特征，二者氨基酸同源性高達(dá)90%，BMP2、BMP4、BMP7是BMPs家族中生物活性最高的3種蛋白[18]。BMPs晶體結(jié)構(gòu)的核心是一個(gè)胱氨酸結(jié)，從核心向外延伸來(lái)自于β鏈和反方向的α螺旋環(huán)的2個(gè)手指樣凸起，α螺旋環(huán)和β鏈則為手指。C端是該家族的保守區(qū)，成熟的BMPs有7個(gè)半胱氨酸，并且位置絕對(duì)保守，其中6個(gè)半胱氨酸形成分子內(nèi)二硫鍵，另一個(gè)半胱氨酸形成分子間二硫鍵，借此分子間二硫鍵連接2條多肽形成二聚體結(jié)構(gòu)[19]。與所有TGF-β家族一樣，BMP2、BMP4在蛋白質(zhì)合成后期氨基端的前肽區(qū)會(huì)被切除，形成具有活性的成熟肽，二聚體的形成和分子成熟的過程可能發(fā)生于細(xì)胞內(nèi)或分泌過程中。因此，只有形成二聚體形式，這些蛋白質(zhì)才具有生物活性，才能啟動(dòng)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)。與石曉衛(wèi)等對(duì)黃淮山羊BMP4的結(jié)構(gòu)與功能的分析結(jié)果[14]一致，BMP2與BMP4具有BMPs家族的典型結(jié)構(gòu)特征，這些結(jié)構(gòu)特征構(gòu)成了它們?cè)诠墙M織形成、原始卵泡發(fā)育及早期胚胎發(fā)育中發(fā)揮作用的基礎(chǔ)[20]。

近年來(lái)，對(duì)山羊和綿羊TGF-β超家族的研究逐漸增多，大量研究表明，BMP-IB、BMP15、GDF9是影響山羊與綿羊多胎的主效基因。BMP2與BMP4作為山羊和綿羊繁殖性狀候選基因的報(bào)道不多，儲(chǔ)明星等檢測(cè)到了小尾寒羊BMP4基因存在多態(tài)性，并命名為AA/AB/BB型，BB型純合子個(gè)體產(chǎn)羔量比AA 型和AB型個(gè)體的平均產(chǎn)羔量多0.6只[21]。徐業(yè)芬等對(duì)湖羊的BMP2、BMP4、BMP6、BMP7基因的mRNA 表達(dá)水平與排卵數(shù)關(guān)系進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，這幾個(gè)基因在卵巢組織中均有表達(dá)，多羔組的BMP4基因mRNA水平極顯著高于單羔組，BMP4基因的mRNA表達(dá)量與湖羊排卵量呈正相關(guān)，可作為影響湖羊排卵數(shù)的候選基因進(jìn)一步研究[22]。目前，已在牛、豬、鼠、雞等多種動(dòng)物卵巢中檢測(cè)到BMP2、BMP4的mRNA，通過旁分泌作用控制顆粒細(xì)胞的增殖與分化，并作用于卵巢、子宮及調(diào)節(jié)生殖內(nèi)分泌系統(tǒng)。因此，開展BMP2、BMP4基因的研究能提高雌性動(dòng)物繁殖力，加快優(yōu)良品種的選育，從而更加合理有效地開發(fā)利用品種資源等。

4 結(jié)論

本研究通過克隆測(cè)序獲得了BMP2基因（GenBank 登錄號(hào)為KF492982）與BMP4基因（GenBank 登錄號(hào)為KF492983）的編碼區(qū)全長(zhǎng)cDNA序列，并運(yùn)用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對(duì)所得基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)二者均有信號(hào)肽，無(wú)跨膜區(qū)，極有可能是定位于細(xì)胞外的分泌型蛋白，并預(yù)測(cè)了蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，通過與其他物種進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，揭示了川中黑山羊與其他物種進(jìn)化的一致性，為后續(xù)研究提供了一定的理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

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4 結(jié)論

本研究通過克隆測(cè)序獲得了BMP2基因（GenBank 登錄號(hào)為KF492982）與BMP4基因（GenBank 登錄號(hào)為KF492983）的編碼區(qū)全長(zhǎng)cDNA序列，并運(yùn)用生物信息學(xué)相關(guān)軟件對(duì)所得基因序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)二者均有信號(hào)肽，無(wú)跨膜區(qū)，極有可能是定位于細(xì)胞外的分泌型蛋白，并預(yù)測(cè)了蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)、三級(jí)結(jié)構(gòu)，通過與其他物種進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹，揭示了川中黑山羊與其他物種進(jìn)化的一致性，為后續(xù)研究提供了一定的理論依據(jù)。

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