高效液相色譜法同時測定連翹葉中連翹酯苷A和連翹苷含量

姬雪禮，李文烈，鄭曉杰，馬艷玲

（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，河北 石家莊 050035）

連翹 Forsythia suspensa（Thunb．）Vahl是木犀科植物連翹屬落葉灌木，其果實(shí)為常用中藥材，具有清熱解毒、消腫散結(jié)、疏散風(fēng)熱的功效[1]，尤其是解熱、抗菌、抗病毒作用顯著。連翹葉中的某些有效成分含量高于連翹果實(shí)，具有明顯的抗氧化、抗衰老等作用[2-5?，部分地區(qū)常用連翹嫩葉制成連翹葉茶飲用，具有較好的保健價值。連翹苷和連翹酯苷A為連翹葉中的主要有效成分，因此本試驗(yàn)中以連翹酯苷A和連翹苷為指標(biāo)[6-7]，建立了快速、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠的可同時測定兩者含量的高效液相色譜（HPLC）法，以期為連翹葉資源的開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜儀，包括2695 Separations Module，2998 Photodiode Array Detector，Empower 2 Software Build 2154 工作站。連翹酯苷A對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為111810-201102，供含量測定用，含量為 93．2%）；連翹苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為110821-200610）；連翹葉（石家莊以嶺藥業(yè)股份有限公司，批號為 20120501，20120901，20120902，20121101)；超純水（Milli-Q Advantage A10 超純水系統(tǒng)），甲醇（Fisher，色譜純）；其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件及系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Agilent Zorbax SB-C18柱（150 mm × 4．6 mm，5 μm）；流動相：甲醇 -0．1% 磷酸溶液（32 ∶68）；流速：1．0 mL ／min；檢測波長：227 nm；柱溫：30℃。理論板數(shù)按連翹酯苷A峰計(jì)算應(yīng)不低于 5 000，色譜圖見圖1。

2．2 溶液制備

精密稱取連翹酯苷A對照品及連翹苷對照品各適量，分別加70%甲醇制成每1 mL含80 μg的溶液，作為對照品溶液。取樣品粉末（過四號篩）約0．2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)15 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，0．22 μm濾膜濾過，作為供試品溶液。取70%甲醇溶液作為空白對照品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別吸取連翹酯苷A對照品溶液、連翹苷對照品溶液、供試品溶液和空白對照品溶液各適量，按擬訂色譜條件進(jìn)樣檢測。結(jié)果陰性無干擾，連翹酯苷A峰、連翹苷峰與其他峰分離良好(圖1)。

線性關(guān)系考察：分別精密吸取質(zhì)量濃度為29．317 0，58．634 0，73．292 5，146．585 0，219．877 4，366．462 4 μg ／mL 的連翹酯苷 A對照品溶液各 10 μL，和質(zhì)量濃度為 33．376 0，66．752 0，83．440 0，166．880 0，250．320 0，417．200 0 μg ／mL 的連翹苷對照品溶液各10 μL，分別注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件測定峰面積，以連翹酯苷 A和連翹苷的進(jìn)樣量（X，ng）為橫坐標(biāo)、峰面積積分值（Y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算得回歸方程 Y連翹酯苷A＝1281．3706X＋4256．8182（r＝0．999980），Y連翹苷＝2034．5969X-10 608．267 0（r＝ 0．999 991）。結(jié)果表明，連翹酯苷 A 和連翹苷進(jìn)樣量分別在 293．170 ～3 664．624，333．760～4 172．000 ng 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度試驗(yàn)：分別取連翹酯苷A對照品溶液和連翹苷對照品溶液（含連翹酯苷 A 73．292 5 μg ／mL，連翹苷 83．440 0 μg ／mL），連續(xù)進(jìn)樣6次，每次10 μL。結(jié)果連翹酯苷A和連翹苷峰面積的RSD分別為0．47%，1．14%，表明儀器精密度好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液10 μL，室溫放置，分別于 0，4，8，12，16，24，40 h 時進(jìn)樣測定。結(jié)果連翹酯苷 A 和連翹苷峰面積的 RSD分別為2．12%，0．91%，表明供試品溶液在40 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品（批號為 20120501），分別取0．16，0．20，0．24 g 3 個樣品量，每個樣品量 3 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果測得連翹酯苷A 的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 20．860 1 mg／g（n＝9），連翹苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 19．178 7 mg／g（n ＝ 9），RSD 分別為 1．54% ，1．01% ，表明方法重復(fù)性好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一批樣品（批號為20120501）9份，每份0．1 g，精密稱定，分別加入高、中、低3個質(zhì)量濃度的連翹酯苷A和連翹苷對照品70%甲醇溶液50 mL，依法平行制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

2．4 樣品含量測定

取不同批次連翹葉粉末，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，以外標(biāo)法峰面積計(jì)算樣品中連翹酯苷A和連翹苷的量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）

3 討論

本試驗(yàn)中色譜條件參考了2010年版《中國藥典（一部）》中“連翹”藥材含量測定項(xiàng)下的色譜條件，曾采用乙腈-0．4%冰醋酸（15 ∶85，17 ∶83，16 ∶84）、甲醇 -0．4% 冰醋酸（40 ∶60）為流動相，結(jié)果連翹酯苷A分離效果不好，后采用甲醇-0．4%冰醋酸（35 ∶65，30 ∶70）及甲醇 - 乙腈 -0．4% 冰醋酸（5 ∶15 ∶80）分離效果仍不理想。采用甲醇 -0．1%磷酸溶液（35∶65）為流動相，經(jīng)調(diào)整流動相的比例，以甲醇 -0．1%磷酸溶液（32∶68）為流動相，連翹酯苷A色譜峰分離較好，色譜峰保留時間較合適，并且連翹苷色譜峰分離度也好。

對連翹酯苷A和連翹苷對照品溶液進(jìn)行光譜檢測，結(jié)果連翹苷在 200，227，276 nm波長處有強(qiáng)吸收，連翹酯苷 A在200，217，328 nm波長處有強(qiáng)吸收。為簡化操作，同時考慮連翹酯苷A與連翹苷吸收峰面積及雜質(zhì)峰的影響，采用227 nm為測定波長。

試驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的方法簡單，操作方便，專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好、結(jié)果可靠，可用于同時檢測連翹葉中的連翹酯苷A和連翹苷成分，為連翹葉資源開發(fā)提供了參考依據(jù)。

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