不同采收季節(jié)的淫羊藿中朝藿定C和淫羊藿苷的含量比較

左建平，安顯輝

（珠海星光制藥有限公司，廣東 珠海 519180）

淫羊藿為小檗科植物淫羊藿 Epimedium brevicornum Maxim．、箭葉淫羊藿 Epimedium sagittatum(Sieb．et Zucc．)Maxim．、柔毛淫羊藿 Epimedium pubescens Maxim．、巫山淫羊藿 Epimedium wushanense T．S．Ying、或朝鮮淫羊藿 Epimedium koreanum Nakai的干燥葉[1]。另外粗毛淫羊藿 E．a(chǎn)cuminutum Franch．、天平山淫羊藿E myrianthum Steam和黔嶺淫羊藿 E．leptorrhizum Steam為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標準》允許使用品種，淫羊藿屬植物在中國約有40余種[2]。淫羊藿 Herba Epimedii有益精氣、堅筋骨、補腰膝、強心力之功效。迄今已報道的淫羊藿屬植物約55種[3]，廣泛分布于除新疆、西藏、內(nèi)蒙古、河北、山東以外的各個省份。貴州是全國淫羊藿藥材產(chǎn)量最大的地區(qū)，主流品種為粗毛淫羊藿，其次為黔嶺淫羊藿、巫山淫羊藿。本研究通過對粗毛、黔嶺、巫山淫羊藿藥材的不同采收季節(jié)、不同產(chǎn)地中淫羊藿苷和朝藿定C的含量進行測定，為貴州產(chǎn)主流淫羊藿藥材的質(zhì)量評價提供科學(xué)依據(jù)，為含淫羊藿藥材的中成藥質(zhì)量控制提供參考。

1 儀器與試藥

HP1100型高效液相色譜儀 (在線脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱、VWD檢測器，ChemStation色譜工作站)；KQ-300DA型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。朝藿定C對照品（自制并鑒定結(jié)構(gòu)，經(jīng)高效液相色譜法檢測純度大于98%）；淫羊藿苷（中國藥品生物制品檢定所，批號為0737-9910）；乙腈為色譜純，水為樂百氏純凈水，其他試劑均為分析純；粗毛淫羊藿、巫山淫羊藿（均自采于貴州省貴陽市修文縣、貴州省貴陽市藥用植物園），黔嶺淫羊藿（自采于貴州省安順市關(guān)嶺自治縣）。

2 方法與結(jié)果

2．1 色譜條件

色譜柱：SinoChrom ODS-AP 柱(250 mm × 4．6 mm，5．0 μm，大連依利特分析儀器有限公司 )；柱溫：25℃；流動相：乙腈(A)-水(B)，梯度洗脫（0 ～22 min，27% →29%A；22 ～23 min，29% →100%A；23～34 min，100%A；34～36 min，100% →27%A；36～50 min，27%A）；流速：1 mL ／min；進樣量：10 μL；檢測波長：270 nm。

2．2 溶液制備

精密稱取朝藿定C和淫羊藿苷對照品，加適量甲醇制成朝藿定 C和淫羊藿苷質(zhì)量濃度分別為1．322，1．513 g／L的混合溶液，搖勻，即得對照品溶液。分別取不同月份的粗毛淫羊藿、巫山淫羊藿、黔嶺淫羊藿粉末(過80目篩)0．2 g（同時另取粗毛淫羊藿、巫山淫羊藿、黔嶺淫羊藿藥材粉末測定水分），精密稱定，置錐形瓶中，加70%乙醇20 mL超聲提取1 h，并補足減失的質(zhì)量，用微孔濾膜(0．45 μm)濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2．3 方法學(xué)考察

系統(tǒng)適用性試驗：分別精密吸取朝藿定C、淫羊藿苷的對照品溶液和混合對照品溶液及3種供試品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色圖譜。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，朝藿定C對照品在14．28 min時出峰，淫羊藿苷對照品在16．89 min時出峰，供試品圖譜在相同時間出現(xiàn)和對照品同樣的峰，且基線較平，雜質(zhì)峰較少，且朝藿定C、淫羊藿苷峰和相近的雜質(zhì)峰分離完全（分離度大于1．5）。見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密稱取干燥的朝藿定C對照品(干燥品按98．0% 計)13．49 mg 和淫羊藿苷對照品 15．13 mg，置 10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得朝藿定C和淫羊藿苷對照品溶液（每1 mL含朝藿定 C 1．322 mg，淫羊藿苷1．513 mg）。精密吸取朝藿定 C對照品溶液1，2，3 mL和淫羊藿苷對照品溶液 0．2，0．4，1 mL，分別置 10 mL 1，2，3 號容量瓶中，再于 1 號瓶中取 1，2，4 mL分別置 4，5，6號 10 mL容量瓶中，并加甲醇定容至刻度，搖勻。分別精密吸取上述6種溶液各10 μL注入高效液相色譜儀，記錄色譜，以峰面積（A）為縱坐標、進樣量（X）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程，朝藿定 C為 A＝18 025．706 4 X＋6．255 671 1（r＝0．999 9）， 淫 羊 藿 苷 為 A＝22 664．828 3 X-3．752 616 4（r＝0．999 9）。結(jié)果表明，朝藿定 C 和淫羊藿苷進樣量在 13．22 ～ 396．6 μg 和 3．026 ～151．3 μg 范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

精密度考察：精密量取朝藿定C質(zhì)量濃度為1．322 g／L的對照品溶液1 mL和淫羊藿苷質(zhì)量濃度為1．513 g／L的標準溶液0．2 mL，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得朝藿定 C質(zhì)量濃度為 132．2 μg／mL和淫羊藿苷質(zhì)量濃度為30．26 μg ／mL 的溶液，精密吸取 10 μL，注入高效液相色譜儀，重復(fù)進樣6次，測定峰面積。結(jié)果朝藿定C的 RSD為0．43%，淫羊藿苷的 RSD為0．49%，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗：依法制備供試品溶液，精密吸取10 μL，分別于0，6，8，12，14 h時注入高效液相色譜儀，測定峰面積。結(jié)果朝藿定C峰面積的 RSD為0．91%，淫羊藿苷峰面積的 RSD為1．05%，表明供試品溶液在14 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗：取粗毛淫羊藿藥材干燥樣品，依法制備5份供試品溶液，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積，計算朝藿定C和淫羊藿苷的平均含量。結(jié)果朝藿定C和淫羊藿苷的平均含量的 RSD分別為0．84%和1．47%，表明該方法重現(xiàn)性良好。

加樣回收試驗：精密稱取已測定含量的樣品 (朝藿定C含量為 0．930 64% ，淫羊藿苷含量為 0．153 18%)0．1 g，置錐形瓶中，分別按80%，100%，120%的比例加入已知質(zhì)量濃度的對照品混合溶液，每個濃度平行3份，共9份，加70%乙醇20 mL超聲提取 1 h，放冷，用 70%乙醇補足減失的質(zhì)量，用 0．45 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液，精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀，測定峰面積。結(jié)果見表1。

表1 朝藿定C和淫羊藿苷加樣回收試驗結(jié)果(n＝9)

2．4 樣品含量測定

將于不同月份采集的淫羊藿藥材的干燥粉末于80℃干燥3 h，依法制備供試品溶液和對照品溶液，分別進樣10 μL，記錄色譜圖，測定峰面積，按公式計算含量。結(jié)果見表2。

表2 3種樣品中朝藿定C和淫羊藿苷含量測定結(jié)果（%）

3 討論

分別考察乙腈-水(28∶72)、乙腈-水(30∶70)及不同乙腈比例在22，24，25 min內(nèi)從27%到29%的3種梯度洗脫條件，結(jié)果以本試驗中采用的分離條件較好，朝霍定C和淫羊藿苷能有效分離。淫羊藿藥材的主要有效成分為黃酮類化合物，其中朝霍定C、淫羊藿苷在藥材中占比較大，而2010年版《中國藥典(一部)》僅以淫羊藿苷作為藥材的含量測定指標，不能客觀反映淫羊藿藥材的內(nèi)在質(zhì)量，應(yīng)以朝霍定C和淫羊藿苷作為淫羊藿藥材的質(zhì)控指標。本方法簡便、快速、準確、重復(fù)性好，能較全面地控制淫羊藿藥材中有效成分的含量，應(yīng)增加淫羊霍苷和朝霍定C作為淫羊藿藥材的質(zhì)控指標。

[1]國家藥典委員會．中華人民共和國藥典(一部)[M]．北京：中國醫(yī)藥科技出版社，2010：306．

[2]王悅云，徐文芬，何順志．中國淫羊藿小花類群的研究現(xiàn)狀[J]．貴陽中醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2005，27(4)：6．

[3]郭寶林，肖培根．中藥淫羊藿主要種類評述[J]．中國中藥雜志，2003，28(4):303．