錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)蛋白在子宮內(nèi)膜非典型增生中的表達(dá)及其意義

古麗米拉·巴依坦， 余 麗， 師曉莉， 張 巍， 苗 娜

(1新疆人口和計(jì)劃生育科研所病理科， 烏魯木齊 830011； 2新疆昌吉市第二人民醫(yī)院病理科， 新疆 昌吉 831100；3新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科， 烏魯木齊 830054)

子宮內(nèi)膜非典型增生(endometrial atypical hyperplasia)被認(rèn)為是子宮內(nèi)膜樣腺癌的前驅(qū)病變[1]，通常經(jīng)歷子宮內(nèi)膜復(fù)雜型增生、非典型增生和癌的演變過程。研究顯示DNA錯(cuò)配修復(fù)基因(DNA mismatch repair gene，MMR)系統(tǒng)對人體細(xì)胞中遺傳物質(zhì)的完整性和穩(wěn)定性起著極為重要的作用。MMR基因能特異性地識別和修復(fù)DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配。目前國內(nèi)外有關(guān)MMR系蛋白在子宮內(nèi)膜非典型增生中變化的研究較少。本研究對50例子宮內(nèi)膜非典型增生組織中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instability，MSI)狀態(tài)與臨床特征的關(guān)系進(jìn)行分析，探討MSI在子宮內(nèi)膜非典型增生中的表達(dá)意義。

1 材料與方法

1.1一般材料隨機(jī)收集新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2006年8月-2013年5月子宮內(nèi)膜非典型增生標(biāo)本50例，其中全子宮切除術(shù)標(biāo)本9例，子宮內(nèi)膜活檢標(biāo)本41例。標(biāo)本均經(jīng)10%的中性福爾馬林固定，石蠟包埋。患者年齡29～71歲，平均年齡45.6歲。組織切片由2名高年資病理醫(yī)師復(fù)閱，按照2004年版《女性生殖道病理學(xué)》[2]，子宮內(nèi)膜非典型增生病理學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)腺上皮細(xì)胞異型、腺體的結(jié)構(gòu)及間質(zhì)的改變進(jìn)行形態(tài)學(xué)診斷，準(zhǔn)確篩選子宮內(nèi)膜非典型病例。另收集正常增生期子宮內(nèi)膜50例標(biāo)本設(shè)為對照組。

1.2子宮內(nèi)膜非典型增生的形態(tài)學(xué)診斷標(biāo)準(zhǔn)腺上皮細(xì)胞大小不等，復(fù)層排列、極向較紊亂；核大，染色質(zhì)粗糙、深染，核仁明顯，核分裂象增多；胞質(zhì)豐富、淡染或嗜酸性。腺體“迷宮”樣排列及背靠背現(xiàn)象。腺體∶間質(zhì)>3∶1；泡沫細(xì)胞增多；無異型細(xì)胞的浸潤。

1.3實(shí)驗(yàn)試劑單克隆鼠源性抗體， MLH1(1∶80)、PMS2( 1∶40)、MSH2 (1∶100)、 MSH6(1∶200)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.4方法采用免疫組化EnVision二步法，病變周圍正常子宮內(nèi)膜、間質(zhì)細(xì)胞和淋巴細(xì)胞作為內(nèi)對照，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明操作。

1.5結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)MMR蛋白正常表達(dá)在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)均可著色。陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)為細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)同時(shí)出現(xiàn)棕黃色顆粒，病變區(qū)域細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)均無著色可判斷為陰性(失表達(dá))。非腫瘤性的內(nèi)膜間質(zhì)及淋巴細(xì)胞核陽性作為內(nèi)對照。MSI結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：錯(cuò)配修復(fù)基因(MMR)中出現(xiàn)2～3個(gè)MMR蛋白表達(dá)缺失者為高頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(high level of microsatellite instability，MSI-H)，只有1個(gè) MMR蛋白表達(dá)缺失者為低頻微衛(wèi)星不穩(wěn)定性 (Low level of microsatellite instability，MSI-L)，4個(gè)MMR均為陽性者為微衛(wèi)星穩(wěn)定性(microsatellite stability，MSS)。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，MMR系蛋白在各組間表達(dá)的比較采用χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組MMR系中MLH1、MSH2、PMS2、MSH6蛋白失表達(dá)情況MLH1、MSH2、PMS2和MSH6蛋白在子宮內(nèi)膜非典型增生組織中失表達(dá)率分別為12%(6/50)、14%(7/50)、 12%(6/50)、 8%(4/50)。MSH2在50例正常增生期子宮內(nèi)膜組中失表達(dá)率為8%(4/50)，其他3種蛋白均無出現(xiàn)失表達(dá)。MLH1、PMS2、MSH6在子宮內(nèi)膜非典型增生中失表達(dá)率高于正常增生期子宮內(nèi)膜，兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，兩組MSH2表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.338)(表1、圖1)。

2.2兩組MSI(MSI-H、MSI-L)與MSS表型子宮內(nèi)膜非典型增生組MMR蛋白失表達(dá)所致的MSI-H表型7例(14%)，MSI-L表型9例(18%)，MSS表型34例(68%)，與正常增生期子宮內(nèi)膜組相比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)(表2)。

2.3子宮內(nèi)膜非典型增生組織中MSI(MSI-H、MSI-L)表型與患者年齡的關(guān)系年齡≤50歲和>50歲子宮內(nèi)膜非典型增生患者中微衛(wèi)星不穩(wěn)定性差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)(表3)。

a: MLH1蛋白在宮內(nèi)膜非典型增生組織腺上皮細(xì)胞核陰性表達(dá)

b: MSH6蛋白在增生期子宮內(nèi)膜組織腺上皮細(xì)胞核呈棕黃色陽性表達(dá)

表1 兩組MMR蛋白的表達(dá)情況/例(%)

表2 兩組MSI(MSI-H、MSI-L)和MSS狀態(tài)/例(%)

表3 子宮內(nèi)膜非典型增生病變中的MSI(MSI-H、MSI-L)和MSS狀態(tài)與年齡的關(guān)系/例

3 討論

MMR系統(tǒng)最初于大腸桿菌中被發(fā)現(xiàn)，迄今為止已分離鑒定9種人類同源MMR基因，其中能參與MMR作用或識別錯(cuò)配堿基及新生DNA鏈的基因組主要為MLH1、MSH2、PMS2和MSH6，該MMR系在維持基因穩(wěn)定性方面發(fā)揮著重要作用。細(xì)胞正常復(fù)制過程中DNA靠A-T、 G-C之間的氫鍵互補(bǔ)配對來維持螺旋結(jié)構(gòu)，而MMR(MLH1、MSH2、PMS2、MSH6)系主要是能識別和修復(fù)DNA復(fù)制中的錯(cuò)配堿基，降低基因突變，保證遺傳保守性和穩(wěn)定性。

微衛(wèi)星不穩(wěn)定性是癌基因和抑癌基因之后，腫瘤分子發(fā)病機(jī)制的又一重大進(jìn)展，是一種腫瘤形成的機(jī)制[3]。一般表現(xiàn)為編碼區(qū)基因突變或蛋白失表達(dá)，失去對損傷進(jìn)行修復(fù)功能。有關(guān)腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，MSI表型腫瘤中頻繁出現(xiàn)MMR基因突變或功能蛋白缺失，MSI檢測已經(jīng)成為篩選錯(cuò)配修復(fù)基因突變腫瘤的一種重要方法，MMR基因喪失錯(cuò)配修復(fù)功能時(shí)DNA復(fù)制過程中出現(xiàn)的堿基錯(cuò)配和缺失不能被修復(fù)，表現(xiàn)為高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(high level of microsatellite instability，MSI-H)[4]。另外有研究顯示，結(jié)直腸癌等腫瘤中MSI-H表型的生物學(xué)行為及預(yù)后等與MSS/MSI-L表型腫瘤存在顯著差別[5-6]。當(dāng)前研究普遍認(rèn)為子宮內(nèi)膜癌是由正常子宮內(nèi)膜復(fù)雜型增生至非典型增生病變逐步發(fā)展而來的。不典型增生婦女若不經(jīng)治療則有20%～52%的病例可發(fā)展為子宮內(nèi)膜癌[1]。子宮內(nèi)膜在各種刺激因素作用下增生活躍時(shí)，組織中DNA復(fù)制頻繁，堿基錯(cuò)配率增多，功能區(qū)MMR基因突變導(dǎo)致蛋白缺陷。

Wang等[7]的動物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PTEN(屬于抑癌基因，位于10q23.3)突變的子宮內(nèi)膜不典型增生小鼠如果合并MLH1突變，短時(shí)間內(nèi)發(fā)生癌變，表明錯(cuò)配修復(fù)基因MLH1突變可以促進(jìn)子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。本研究顯示，MMR(MLH1、MSH2、PMS2、MSH6)蛋白在子宮內(nèi)膜非典型增生組織中的失表達(dá)率分別為12%(6/50)、14%(7/50)、12%(6/50)、8%(4/50)；MSH2在正常增生期子宮內(nèi)膜組織中失表達(dá)率為 8%(4/50)；MLH1、PMS2、MSH6在子宮內(nèi)膜非典型增生組的失表達(dá)率顯著高于正常增生期子宮內(nèi)膜組(P<0.05)，而兩組MSH2的失表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.338)，提示非典型增生病變有惡變的傾向；MMR蛋白在正常的子宮內(nèi)膜中具有修復(fù)錯(cuò)配堿基的作用，而非典型增生組織中有不同程度的蛋白失表達(dá)，表明在子宮內(nèi)膜異常增生時(shí)MMR蛋白缺失引起錯(cuò)配修復(fù)功能的降低或喪失，增加腫瘤易感性[8]。

Sherman等[9]研究表明，子宮內(nèi)膜非典型增生和子宮內(nèi)膜樣腺癌具有相似的分子生物學(xué)改變。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(MSI)出現(xiàn)于28%的非典型增生病變和子宮內(nèi)膜樣腺癌中。本研究通過4種蛋白失表達(dá)率檢測非典型增生子宮內(nèi)膜組織中的 MSI表型為32%(16/50)，略高于文獻(xiàn)[9]報(bào)道結(jié)果,其中子宮內(nèi)膜非典型增生組MSI-H(7/50)、MSI-L(9/50)表型高于正常增生期子宮內(nèi)膜組MSL-L(4/50)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.005)。有關(guān)子宮內(nèi)膜癌前病變的微衛(wèi)星不穩(wěn)定性研究顯示， MSI表型的內(nèi)膜腺癌組織周圍的非典型增生病變也為MSI表型，子宮內(nèi)膜腺癌和內(nèi)膜非典型增生病變屬于同一譜系[10]，MSI表型內(nèi)膜非典型增生性病變更易通過連續(xù)的克隆性變化發(fā)展為癌。

發(fā)病年齡是腫瘤研究中的重要因素，因而癌前病變發(fā)展為癌之前，通過對高危年齡組人群進(jìn)行基因檢測篩選MMR基因突變者，可實(shí)現(xiàn)腫瘤相關(guān)的預(yù)防措施及早期診斷[11]。研究顯示，子宮內(nèi)膜非典型增生患者平均年齡為(50±11)歲[12]，多處于圍絕經(jīng)期。本組患者平均年齡為45.6歲。本研究進(jìn)一步分析了微衛(wèi)星不穩(wěn)定性與內(nèi)膜非典型增生患者年齡的關(guān)系，年齡≤50歲者M(jìn)SI-H和MSS表型高于年齡>50歲者，相反，>50歲者M(jìn)SI-L表型高于≤50歲者，但差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001) 。目前認(rèn)為MSI-H是一個(gè)獨(dú)立群體[13]，在低分化腫瘤中的比率高，并且預(yù)后差。本研究結(jié)果驗(yàn)證了在子宮內(nèi)膜非典型增生中所檢測到的MSI-H與患者年齡的相關(guān)性。但目前研究對MSI-L的所占比例和其特點(diǎn)還不是很清楚，主要是對MSI-L的定義尚不是很明確，在研究中對MSI-L判定標(biāo)準(zhǔn)差異很大，因此有待于進(jìn)一步研究。

綜上所述，MMR蛋白失表達(dá)及MSI(MSI-H)可能是子宮內(nèi)膜非典型增生的分子事件，了解MSI-H表型在子宮內(nèi)膜非典型增生中的表達(dá)及意義，可為病變的預(yù)防與早期診斷提供更多信息。

參考文獻(xiàn):

[1] Kurman R, Kaminiski P, Norris H. The behavior of endometrial hyperplasia a long-term study of “untreated” hyperplasia in 170 patients[J]. Cancer Res , 1985, 56(2):403-412.

[2] 回允中. 女性生殖道病理學(xué)[M]. 北京：北京大學(xué)醫(yī)學(xué)出版社, 2004:314-316.

[3] Gologan A, Krasinskas A, Hunt J, et al. performance of the revised Bethesda guidelines for identification of colorectal carcinomas with a high level of microsatellite instability[J]. Arch Pathol Lab Med, 2005,129(11):1390-1397.

[4] Iacopetta B, Grieu F, Amanuel B. Microsatellite instability in colorectal cancer[J]. Asia Pac J Clin Oncol, 2010,6(4):260-269.

[5] Jung SB, Lee HI, Oh HK, et al. Clinicopathologic parameters for prediction of microsatellite instability in colorectal cancer[J]. Cancer Res Treat, 2012,44(3):179-186.

[6] 孟曉明， 盛劍秋， 武子濤， 等.根據(jù)臨床病理學(xué)特征鑒別無家族史MSI-H大腸癌[J]. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床，2010，30(3)：252-256.

[7] Wang H, Douglas W, Lia M, et al . DNA mismatch repair deficiency accelerates endometrial tumorigenesis in Pten heterozygous mice [J] . Am J Pathol , 2002, 160(4)：1481-1486.

[8] 吳海霞 ，宋劍嬋，師宜荃，等.錯(cuò)配修復(fù)基因在50歲以下子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)[J]. 中華病理學(xué)雜志，2012，41(11)：733-736.

[9] Sherman ME. Theories of endometrial carcinogenesis:a multidisciplinary approach. [J]. Mod Pathol,2000,13(3):295-308.

[10] Levine RL, Cargile CB, Blazes MS, et al. PTEN Mutations and Microsatellite Instability in Complex Atypical Hyperplasia, a precursor Lesion to Uterine Endometrioid Carcinoma [J] . Cancer Res, 1998, 58(15):3254-3258.

[11] Backes FJ, Mitchell E, Hampel H, et al . Endometrial cancer patients and compliance with genetic counseling： room for improvement[J]. Gynecol Oncol, 2011, 123(3)：532-536.

[12] 王志啟，楊筱青，王建六， 等．子宮內(nèi)膜非典型增生79例臨床病理特征分析[J]. 中華婦產(chǎn)科學(xué)雜志,2011，46(1)：19-23．

[13] Laghi L, Bianchi P, Malesci A. Differences and evolution of the methods for the assessment of microsatellite instability[J]. Oncogene, 2008, 27(49):6313-6321.