復(fù)方唇香草顆粒干預(yù)As斑塊炎癥反應(yīng)信號通路的實(shí)驗(yàn)研究

袁 爽， 伍 倩， 陳 悅， 辛效毅

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)內(nèi)科， 烏魯木齊 830054)

近年來心腦血管疾病已成為人類的第一殺手，而動(dòng)脈粥樣硬化(As)又是多數(shù)心腦血管疾病發(fā)生的前期病理基礎(chǔ)。As的病理實(shí)質(zhì)是一種炎癥反應(yīng)[1]，是斑塊不穩(wěn)定、發(fā)生破裂的中心環(huán)節(jié)[2]。目前通過抑制炎癥反應(yīng)來延緩患者As的發(fā)生發(fā)展，特別是穩(wěn)定斑塊、防止破裂，已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的重要研究方向。以維吾爾藥為主的復(fù)方唇香草顆粒是新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科根據(jù)新疆地域特點(diǎn)和新疆心腦血管疾病發(fā)病學(xué)特點(diǎn)總結(jié)出的經(jīng)驗(yàn)方，臨床療效顯著。本研究通過復(fù)方唇香草顆粒對Apo-E基因敲除小鼠As斑塊內(nèi)IκK-β/IκB-α/NF-κB 信號通路的影響，探討其穩(wěn)定As斑塊作用的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物6～8周齡Apo-E基因敲除小鼠(品系C57BL/6J，北京大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心自美國Jackson實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)并培育)70只，均為雄性，體質(zhì)量18～20 g，飼以含脂肪15%、膽固醇2%的高脂飼料(60鈷γ滅菌照射處理)，飼養(yǎng)條件為2級，室溫保持在22℃～24℃，相對濕度為50%，光照時(shí)間為北京時(shí)間07∶00～19∶00。

1.2藥物、試劑與儀器復(fù)方唇香草顆粒(唇香草、脫力草、苦參、紅景天、漢防已、葛根)由新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室制備，根據(jù)臨床人擬用量與小鼠劑量轉(zhuǎn)換因子轉(zhuǎn)換的使用劑量為：高劑量組0.318 g/20 g，中劑量組0.159 g/20 g，小劑量組0.080 g/20 g，用蒸餾水配制成0.84 g/mL 濃度混懸液；血脂康片(規(guī)格：0.30 g/粒，國藥準(zhǔn)字Z10950029，北大維信生物科技有限公司)，用蒸餾水配制成0.2 mL/20 g；辛伐他汀片(規(guī)格：20 mg/粒；，國藥準(zhǔn)字H10970385，由默沙東制藥有限公司提供)，用蒸餾水配制成1 mL/mg；IκK-β原位雜交試劑盒(北京新生命生物制藥有限公司),IκB-α原位雜交試劑盒(北京新生命生物制藥有限公司),NF-κB 原位雜交試劑盒(北京新生命生物制藥有限公司),濃縮型胃蛋白酶液,3% 檸檬酸溶液,DAB 顯色劑；OLYMPUS BH2光學(xué)顯微鏡(日本OLYMPUS公司)，LKB-V切片機(jī)(瑞典LKB公司)，SN-695型γ測量儀(上海核子所，日環(huán)光電儀器廠),ABI-7300型Real-time檢測儀(美國ABI公司)。

1.3方法

1.3.1 模型的建立 Apo-E基因敲除小鼠飼以含脂肪15%、膽固醇2%的高脂飼料(60鈷γ滅菌照射處理)，12 w后，隨機(jī)處死10只，取主動(dòng)脈根部，HE染色普通光鏡下觀察，確定As形成。

1.3.2 分組及標(biāo)本處理 其余小鼠隨機(jī)分為6組：模型組(生理鹽水組)、中藥對照組、西藥對照組及復(fù)方唇香草顆粒高、中、低劑量組，每組各10只。根據(jù)成人每日用藥臨床推薦的常用量，按體質(zhì)量系數(shù)比折算成小鼠用量，藥物溶于蒸餾水，灌胃給藥，每日1次。喂養(yǎng)12 w后，處死全部小鼠，取出腹主動(dòng)脈生理鹽水沖洗后，立即置入 4 %多聚甲醛(含0.1%的DEPC)固定液固定48 h，待其有一定硬度后，取出動(dòng)脈，標(biāo)本按照梯度酒精脫水、浸蠟、包埋，沿橫切面將標(biāo)本連續(xù)切片。

1.4原位雜交法檢測IκK-β、IκB-α和NF-κBmRNA的表達(dá)按照試劑盒說明書進(jìn)行原位雜交，雜交后細(xì)胞核進(jìn)行常規(guī)蘇木素染色；石蠟切片常規(guī)脫蠟入水；3% 過氧化氫室溫反應(yīng)10 min；3% 檸檬酸新鮮稀釋的胃蛋白酶室溫消化15 min；預(yù)雜交液37℃反應(yīng)2～4 h；雜交液37℃過夜；封閉液37℃反應(yīng)30 min；生物素化鼠抗地高辛37℃反應(yīng)60 min；SABC37℃反應(yīng)20 min；生物素化過氧化物酶37℃反應(yīng)20 min；DAB 顯色5～10 min，必要時(shí)蘇木素復(fù)染，充分水洗；酒精梯度脫水，二甲苯透明，封片。原位雜交陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)：在光學(xué)顯微鏡400倍視野下，分別在內(nèi)膜、肩區(qū)、纖維帽和基底部各選取2個(gè)陽性表達(dá)比較集中的視野，進(jìn)行陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)，求其平均值。

2 結(jié)果

2.1確定As斑塊的形成高脂喂養(yǎng)12 w后，HE染色顯示小鼠主動(dòng)脈根部已形成明顯的As斑塊，內(nèi)膜明顯增厚，內(nèi)皮下、斑塊內(nèi)有膽固醇結(jié)晶，纖維帽形成，確定動(dòng)脈粥樣硬化斑塊已形成。

2.2各給藥組對小鼠斑塊內(nèi)NF-κBmRNA、IκK-βmRNA、IκB-αmRNA表達(dá)的影響與模型組比較，中藥對照組、西藥對照組及復(fù)方唇香草顆粒高、中、低劑量組IκK-β和NF-κB mRNA的表達(dá)降低(P<0.01)，IκB-αmRNA的表達(dá)增高(P<0.05)；而西藥對照組與復(fù)方唇香草顆粒高、中劑量組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),見表1。

表1 各給藥組對小鼠斑塊內(nèi) NF-κBmRNA、IκK-β、IκB-αmRNA表達(dá)的影響

注：與模型組相比，#P<0.01；與中藥對照組相比，*P<0.05；與復(fù)方唇香草顆粒低劑量組相比，▲P<0.05。

3 討論

陳孝東等[3]報(bào)道As 是一種多發(fā)性動(dòng)脈內(nèi)膜慢性炎癥性疾病。斑塊內(nèi)脂質(zhì)的沉積可抑制細(xì)胞外基質(zhì)合成、促進(jìn)斑塊內(nèi)血管新生，在炎癥介質(zhì)誘導(dǎo)下導(dǎo)致斑塊破裂出血[4-7]。

NF-κB作為一種轉(zhuǎn)錄因子，存在于單核細(xì)胞、血管內(nèi)皮和血管平滑肌細(xì)胞中，是調(diào)節(jié)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子之一，參與許多與炎癥反應(yīng)有關(guān)的基因的表達(dá)調(diào)控，從而加速了As的發(fā)生發(fā)展。IκK 是通過激活NF-κB的抑制蛋白IκB的降解而激活 NF-κB的上游激酶。當(dāng)細(xì)胞受到上游刺激因子作用時(shí)，NF-κB誘導(dǎo)激酶(NIK)可被激活，NIK 激活I(lǐng)KB激酶(IKK)進(jìn)一步致使IKB分子磷酸化降解，NF-κB與IKB三聚體解離釋放NF-κB，激活NF-κB信號途徑。IκK-β/IκB-α/NF-κB信號通路是促炎癥基因表達(dá)的樞紐之一。NF-κB及IκK-β被激活后，將導(dǎo)致炎癥相關(guān)因子的過度表達(dá)，引起明顯的炎癥反應(yīng)。而IκB-α在動(dòng)脈壁內(nèi)的含量高低則決定NF-κB及IκK-β mRNA的表達(dá)，IκB-α可以抑制NF-κB及IκK-β mRNA的表達(dá)，反之則促進(jìn)其表達(dá)，正確調(diào)整主動(dòng)脈壁IκK-β/IκB-α/NF-κB mRNA的表達(dá)可有效降低動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展，從而降低心腦血管疾病的死亡率。

復(fù)方唇香草顆粒是新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科根據(jù)新疆地域特點(diǎn)和新疆心腦血管疾病發(fā)病學(xué)特點(diǎn)經(jīng)過幾代中醫(yī)人總結(jié)出的以維吾爾藥、地產(chǎn)藥為主的經(jīng)驗(yàn)方，在臨床上獲顯著療效。復(fù)方唇香草顆粒中的維吾爾藥唇香草又名蘇則，維醫(yī)用于治療心臟病、胃病等，具有芳香開泄、舒展清陽、強(qiáng)心利濕、理氣化痰等功效，唇香草能抑制脂質(zhì)在動(dòng)脈內(nèi)壁的沉積，從而有效地抑制內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子-1的表達(dá)，具有抑制NF-κB mRNA表達(dá)的作用；脫力草又名仙鶴草，具有活血、散痞、強(qiáng)心、活化PPAR-γ的作用；苦參清熱燥濕、利尿，有降血脂、抗炎作用；紅景天有補(bǔ)氣養(yǎng)血、和血化瘀之功，可抑制血管細(xì)胞粘附分子-1(ICAM-1)的表達(dá)，抑制血管壁炎癥細(xì)胞的釋放；漢防己具有抗心律失常、降血壓、抗心肌缺血之功，可活化PPAR-γ，減少炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子的產(chǎn)生和釋放；葛根具有擴(kuò)張血管、促進(jìn)血液循環(huán)和降壓、降脂作用。諸藥合用共奏益氣活血、升陽利濕、祛瘀化濁之功，減緩動(dòng)脈粥樣硬化炎癥反應(yīng)程度，降低心腦血管事件的發(fā)生率。

本研究顯示，與模型組相比，復(fù)方唇香草顆粒高、中、低劑量組及西藥對照組、中藥對照組小鼠主動(dòng)脈壁IκK-β及NF-κBmRNA的陽性表達(dá)均有不同程度的降低；與中藥對照組及復(fù)方唇香草顆粒低劑量組相比，復(fù)方唇香草顆粒中劑量組、高劑量組及西藥對照組有不同程度的降低，提示復(fù)方唇香草顆粒和辛伐他汀抗動(dòng)脈粥樣硬化作用可能是通過抑制主動(dòng)脈壁IκK-β、NF-κB mRNA的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的；復(fù)方唇香草顆粒中、高劑量組及西藥對照組小鼠主動(dòng)脈壁IκB-αmRNA的陽性表達(dá)有不同程度的升高，提示復(fù)方唇香草顆粒和辛伐他汀均可促進(jìn)主動(dòng)脈壁IκB-α水平，從而抑制主動(dòng)脈壁NF-κB mRNA的表達(dá)，發(fā)揮其抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。

綜上所述，復(fù)方唇香草顆粒具有抗動(dòng)脈粥樣硬化的作用，其機(jī)制可能與抑制NF-kB與IκK-β、提高IκB-αmRNA的表達(dá)、調(diào)控IκK-β/IκB-α/NF-κB 信號通路的活動(dòng)而抑制炎癥反應(yīng)有關(guān)。

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