黃連上清丸中金胺O的檢測(cè)方法研究*

吳 萌，饒偉文

（廣西壯族自治區(qū)桂林食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 桂林 541002）

黃連上清丸為國(guó)家基本藥物收載于2010年版《中國(guó)藥典（一部）》，由黃連、黃芩、黃柏和大黃等17味中藥組方，具有散風(fēng)清熱、瀉火止痛的功效，用于風(fēng)熱上攻、肺胃熱盛所致的頭暈?zāi)垦?、暴發(fā)火眼、牙齒疼痛、口舌生瘡、咽喉腫痛、耳痛耳鳴、大便秘結(jié)、小便短赤等[1]。由于市售的黃連、黃芩、黃柏均有染色摻假現(xiàn)象[2－5]，且僅按藥典收載的檢測(cè)項(xiàng)目還無(wú)法檢測(cè)這些摻假情況。黃連上清丸生產(chǎn)企業(yè)達(dá)100多家，中成藥生產(chǎn)環(huán)節(jié)極有可能有摻假中藥材流入。為此，本研究中，在原有研究成果[3－5]的基礎(chǔ)上，建立了檢查黃連上清丸中可能摻入的金胺O的方法。

1 儀器與試藥

Waters 2695型高效液相分離系統(tǒng)－Quattro Micro質(zhì)譜聯(lián)用儀，Waters 2998型 PAD檢測(cè)器。金胺 O（Auramine O，中國(guó)醫(yī)藥＜集團(tuán)＞上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)為F20020818）；乙腈、乙酸銨、冰醋酸為色譜純，其余試劑均為分析純，水為純化水。按照處方工藝，自制黃連上清丸樣品（金胺O陰性對(duì)照品），并另外加入適量金胺O作為陽(yáng)性對(duì)照品；黃連上清丸（市售，批號(hào)見表2）。

2 方法與結(jié)果

2．1 高效液相色譜－二級(jí)管陣列檢查法（HPLC－DAD）檢測(cè)

2．1．1 色譜條件

色譜柱：用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；流動(dòng)相：乙腈－含 0．5% 冰醋酸的 0．05 mol／L 乙酸胺溶液（28 ∶72）；檢測(cè)波長(zhǎng)：432 nm。理論板數(shù)按金胺O主峰計(jì)算不低于2 000。

2．1．2 溶液制備

精密稱取金胺O適量，加70%乙醇制成每1 mL中含5 μg的溶液，作為對(duì)照品溶液。取供試品，包括金胺O陰性對(duì)照品和陽(yáng)性對(duì)照品粉末3 g，加70%乙醇25 mL，密塞，超聲處理20 min，濾過，量取續(xù)濾液5 mL，濾液通過中性氧化鋁柱（100～200目，內(nèi)徑為 1．5 cm，5 g），以 25 mL 95%乙醇洗脫，收集流出液，蒸干，殘?jiān)?0%乙醇5 mL使溶解，作為供試品溶液。

2．1．3 測(cè)定法

取供試品溶液10 μL，對(duì)照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀，記錄色譜圖。如果供試品出現(xiàn)與金胺O對(duì)照品保留時(shí)間相同的色譜峰，則比較二者的UV光譜圖。結(jié)果陽(yáng)性樣品溶液呈現(xiàn)與對(duì)照品溶液保留時(shí)間相同的色譜峰，而且該色譜峰在300～500 nm波長(zhǎng)范圍的吸收光譜相同，而陰性對(duì)照品溶液則無(wú)相對(duì)應(yīng)的色譜峰，見圖1。

2．2 高效液相色譜－質(zhì)譜法（HPLC－MS）確證

2．2．1 色譜條件

色譜柱：Waters Xterra（R）MS C18柱（150 mm ×2．1 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈 －0．01 mol／L 乙酸銨溶液（22∶78），流速：0．3 mL ／min，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：35 ℃。

2．2．2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI）正離子檢測(cè)；毛細(xì)管電壓：3．0 kV；錐孔電壓：35 V；脫溶劑氣流速 350 L ／h，錐孔氣流速：50 L ／h；源溫度：110℃；去溶劑氣溫度：350℃。掃描方式采用全掃描一級(jí)質(zhì)譜、全掃描二級(jí)質(zhì)譜（MS／MS）。m／z范圍為 50～300 amu。

圖1 HPLC－DAD色譜圖與光譜圖

2．2．3 檢測(cè)結(jié)果

取上述陽(yáng)性樣品以及金胺O對(duì)照品溶液，用HPLC－MS檢測(cè)。結(jié)果二者出現(xiàn)相同的選擇離子流色譜峰，且其分子離子峰m／z均為268，碎片離子峰m／z均為147（見圖2）。因此，確證檢出金胺O。

2．3 高效液相色譜（HPLC）法方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：上述2．1項(xiàng)下的試驗(yàn)已證實(shí)本法對(duì)金胺O的檢測(cè)具有專屬性，不受黃連上清丸中有關(guān)成分的干擾。

儀器檢測(cè)限與定量限確定：當(dāng)信噪比為3時(shí)，測(cè)得儀器檢測(cè)限為 0．004 μg；當(dāng)信噪比為 10 時(shí)，測(cè)得儀器定量限為 0．008 μg。

方法檢測(cè)限與定量限確定：取金胺O對(duì)照品適量，加入陰性樣品中，按2．1項(xiàng)下方法提取、凈化、測(cè)定。當(dāng)信噪比為3時(shí)，測(cè)得方法檢測(cè)限為3．5μg／g；當(dāng)信噪比為10時(shí)，測(cè)得方法定量限為7μg／g。

線性關(guān)系考察：精密稱取金胺O對(duì)照品10．21 mg，置100 mL容量瓶中，加70%乙醇溶解并稀釋至刻度，搖勻。再分別精密量取金胺 O 對(duì)照品溶液 1 mL，分別置 5，10，20，25，50，100 mL 容量瓶中，加70%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，分別用0．45 μm的微孔濾膜過濾，再取濾液分別進(jìn)樣，按擬訂色譜條件測(cè)定。以對(duì)照品質(zhì)量濃量為橫坐標(biāo)（X，μg／mL）、峰面積積分值為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝61 274X－1 814，r＝0．999 9（n＝6）。結(jié)果表明，金胺O質(zhì)量濃度在1～20 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積呈良好線性關(guān)系。

圖2 HPLC－MS一級(jí)質(zhì)譜和二級(jí)質(zhì)譜圖

精密度試驗(yàn)：取同一對(duì)照品溶液，在同一色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣 6次，每次 10 μL。結(jié)果金胺 O主峰峰面積RSD＝1．4% （n＝6），表明儀器精密度良好。

加收率試驗(yàn)：取黃連上清丸陰性樣品9份，每份3g，精密稱定，分別加入適量金胺O對(duì)照品，使加入量為方法檢測(cè)限、2倍方法檢測(cè)限、10倍方法檢測(cè)限，按2．1項(xiàng)下方法提取、凈化、測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

2．4 樣品含量測(cè)定

取市場(chǎng)調(diào)查中收集的9批黃連上清丸樣品，按上述2．1項(xiàng)和2．2項(xiàng)下方法進(jìn)行定性和定量測(cè)定。結(jié)果見表2。

3 討論

金胺O（C17H22N3Cl）又名堿性嫩黃、堿性熒光黃、金絲雀黃、鹽酸氨基四甲基二氨基苯甲烷等，是一種化工染料，屬于接觸性致癌物，在國(guó)外早已列為禁用染料，更不能用于食品著色[6]。該品已被用于黃連、黃芩、黃柏的染色摻假，對(duì)于以此為原料生產(chǎn)的中成藥，有必要增加金胺O的補(bǔ)充檢測(cè)方法。從表2的檢測(cè)結(jié)果可見，9批黃連上清丸中有1批檢出金胺O，HPLC－DAD法與HPLC－MS的檢測(cè)結(jié)果一致，沒有誤判現(xiàn)象出現(xiàn)。因此，所建立的可作為本產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)控的補(bǔ)充檢測(cè)方法。

表1 金胺O回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝9）

在制備供試品溶液時(shí)，比較了不同的提取溶劑，即70%乙醇、乙醇、無(wú)水乙醇，結(jié)果70%乙醇提取率較高；在提取方法的選擇上，比較了回流、超聲及振搖，結(jié)果都較好，但超聲提取簡(jiǎn)便、迅速。對(duì)超聲處理30，20，15，10 min的測(cè)定結(jié)果進(jìn)行比較，表明超聲處理30 min和20 min含量基本一致。

將樣品通過中性氧化鋁柱，目的是為了除去處方中大黃的蒽醌類成分的干擾，提高方法檢測(cè)限。比較了70%乙醇、乙醇、無(wú)水乙醇3種洗脫劑，70%乙醇洗脫力較強(qiáng)，蒽醌類成分也會(huì)被洗脫下來；無(wú)水乙醇在中性氧化鋁柱上的通過率較低，洗脫時(shí)間長(zhǎng)；故選擇乙醇作為洗脫劑。且金胺O其水溶液溫度超過70℃時(shí)會(huì)分解為四甲基苯甲酮，乙醇含水量低，易低溫蒸干，便于定量分析。

對(duì)于HPLC流動(dòng)相的選擇，比較了多個(gè)洗脫系統(tǒng)的流動(dòng)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用文中流動(dòng)相分離效果最佳。通過改變流動(dòng)相比例、流速、柱溫，在不同的儀器、色譜柱和不同的人員操作，檢測(cè)結(jié)果基本一致。

表2 9批市售黃連上清丸檢測(cè)結(jié)果

在研究檢測(cè)方法時(shí)，曾采用TLC法進(jìn)行初篩，但由于存在金胺O不易富集、蒽醌類成分干擾較大、檢測(cè)靈敏度不高的缺點(diǎn)而放棄，直接采用HPLC法進(jìn)行定性、定量測(cè)定。

[1]國(guó)家藥典委員會(huì)．中華人民共和國(guó)藥典（一部）[M]．北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：1 066．

[2]饒偉文，蔣 玲，趙純玉，等．幾種染色摻假中藥的化工染料鑒定[J]．藥物分析雜志，2007，27（11）：1 742 － 1 745．

[3]莫連峰，饒偉文，趙純玉．高效液相色譜法測(cè)定染色黃芩中金胺O的含量[J]．中國(guó)藥業(yè)，2007，16（15）：29 －30．

[4]吳 萌，饒偉文．染色黃柏中金胺O的檢測(cè)方法研究[J]．中國(guó)藥師，2011，14（8）：1 112 － 1 114．

[5]蔣 玲，彭飛燕，饒偉文，等．染色黃連中金胺O的檢測(cè)方法研究[J]．中草藥，2011，42（7）：1 344 － 1 347．

[6]章 杰．禁用染料和環(huán)保型染料[M]．北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2001：1，72 － 73．