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    十六烷基三甲基溴化銨強化產(chǎn)氫發(fā)酵

    2014-07-13 07:07:50任云利楊松波
    關(guān)鍵詞:產(chǎn)氫外膜通透性

    任云利,李 欣,張 柯,楊松波

    (河南科技大學化工與制藥學院,河南洛陽471023)

    0 引言

    化石燃料是當今人類生產(chǎn)、生活的主要能源。隨著全球能量需求的增長,化石燃料等不可再生能源將日趨枯竭。氫能因具有可再生性和對環(huán)境友好的特性,成為最理想的能源載體之一。在各種產(chǎn)氫方法中,厭氧發(fā)酵制氫因其能耗低且可利用的底物廣泛,受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注。通過優(yōu)化發(fā)酵條件(如發(fā)酵溫度、pH和底物濃度等)實現(xiàn)產(chǎn)氫過程的強化已經(jīng)做了大量的研究[1]。近幾年,一些研究者嘗試在培養(yǎng)基中添加微生物生長代謝所需要的微量化學物質(zhì)(如金屬離子、煙酸、乳酸和L-半胱氨酸)實現(xiàn)強化發(fā)酵產(chǎn)氫[2-5]。

    各種類型微生物的產(chǎn)氫過程都是氫酶催化的可逆的氧化還原反應。降低氫氣分壓,有利于可逆反應向著產(chǎn)氫方向進行。一些研究者通過降低發(fā)酵容器上空的氫氣分壓實現(xiàn)了累計產(chǎn)氫量的提高[6-7]。事實上,微生物細胞內(nèi)所產(chǎn)生的氫氣首先要經(jīng)過細胞膜釋放到培養(yǎng)基,然后再擴散至反應器的上空。而由細胞膜的流動性所形成的孔徑(不超過0.5~1.0 nm)僅僅略大于氫氣分子的空氣動力學直徑(0.3 nm)。因此,推測出提高微生物胞外膜的通透性,有可能從根本上降低胞內(nèi)的氫氣分壓,從而促進產(chǎn)氫代謝。文獻[8]報道經(jīng)表面活性劑處理過的紅酵母細胞或者重組大腸桿菌細胞能顯著提高胞外膜的通透性,最終有效提高反式肉桂酸的轉(zhuǎn)化率。文獻[9]研究得出將十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)加入產(chǎn)氣腸桿菌(一種高效產(chǎn)氫菌)整細胞的懸浮液中,胞內(nèi)氫酶的活性可以得到檢測。因此,本文嘗試添加CTAB以提高產(chǎn)氫菌胞外膜的通透性,從而實現(xiàn)強化產(chǎn)氫的目的。

    木糖是自然界中大量存在的植物纖維水解后的重要單糖之一。以木糖為碳源,研究混合菌發(fā)酵過程中CTAB對菌體胞外膜通透性、對細菌生長和對累計產(chǎn)氫量、產(chǎn)氫速率的影響。這種通過添加微量的表面活性劑以強化產(chǎn)氫的方法為將來厭氧發(fā)酵制氫的研究拓展了思路。

    1 材料和方法

    1.1 菌種和培養(yǎng)基

    試驗用的混合菌取自洛陽市生生乳業(yè)牛糞沼氣發(fā)酵池。接種之前,混合菌先在100℃條件下處理

    培養(yǎng)基組成:木糖10 g/L,蛋白凍5 g/L,磷酸二氫鉀14 g/L,磷酸氫二鉀6 g/L,硫酸銨2 g/L,檸檬酸鈉1 g/L,七水硫酸鎂0.2 g/L。

    1.2 試驗方法

    胞外膜通透性試驗:將37℃條件下厭氧培養(yǎng)24 h后的新鮮菌液離心、收集菌體,然后用100 mmol的磷酸鹽緩沖液(pH=7)洗滌、離心、重懸后得到OD600(600 nm波長下光密度)為3.31的菌體懸浮液。取4 mL菌體懸浮液和0.2 mL、0~1.2 g/L的CTAB溶液一并裝入7 mL的血清瓶,在37℃ 放置15 min、90 min或135 min。然后在8 944g條件下離心2 min,測上清液在280 nm下的吸光度(A280)。比較不同條件下A280值,分析從胞內(nèi)釋放出蛋白的相對量,從而比較不同條件下胞外膜的通透性。

    批式發(fā)酵試驗:在500 mL的發(fā)酵瓶中裝入100 mL的培養(yǎng)基、5mL濃度為0~1.0 g/L CTAB水溶液,然后接入5 mL熱處理過的混合菌菌液,用橡膠塞密封。向發(fā)酵瓶中鼓吹N210 min,以確保發(fā)酵的厭氧環(huán)境。將發(fā)酵瓶置于水浴搖床,在37℃轉(zhuǎn)速為150 r/min的條件下發(fā)酵,所產(chǎn)生的氣體經(jīng)NaOH堿洗后用排水法收集[10]。

    1.3 分析方法

    氣相色譜檢測生物氣含量:Porapak Q不銹鋼填充柱,柱溫80℃,載氣為氮氣,流速為30 mL/min,進樣室溫度為80℃,檢測室熱導檢測器(TCD),檢測室溫度120℃,橋電流120 mA。

    1.4 產(chǎn)氫速率的計算

    批式發(fā)酵的產(chǎn)氫過程可由Logistic模型[11]

    進行描述,其中,H為t時刻的累計產(chǎn)氫量,mL;P為產(chǎn)氫過程的產(chǎn)氫潛能,mL;λ為產(chǎn)氫過程的停滯時間,h;Rm為最大產(chǎn)氫速率,mL/h。

    2 結(jié)果和討論

    2.1 CTAB對胞外膜通透性的影響

    CTAB與細菌胞外膜的重要組成部分脂多糖的陽離子結(jié)合位點相互作用引起少量脂多糖的溶解,造成胞內(nèi)的一些蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)釋放到胞外。因此,CTAB可提高細胞膜的通透性。CTAB的濃度和對菌體的作用時間對上清液A280的影響見圖1。圖1底部的水平線表明不同濃度的 CTAB水溶液的A280相同,這意味著試驗條件下CTAB濃度的高低對溶液的A280值沒有影響。因此,一定濃度的CTAB與菌體作用后所得上清液的A280的變化與CTAB的濃度無關(guān),而是單純由于胞內(nèi)的一些蛋白質(zhì)和遺傳物質(zhì)釋放到胞外所引起的;不同CTAB濃度下所得上清液A280的大小表征了不同CTAB濃度下細胞膜的通透性的高低。

    由圖1可看出:當CTAB的濃度小于0.004 8 g/L時,A280未見明顯變化;當CTAB的濃度大于0.009 5 g/L時,A280隨著CTAB濃度的增加而顯著增加。這表明當CTAB的濃度小于0.004 8 g/L時,CTAB對菌體胞外膜的通透性幾乎沒有影響;而當CTAB的濃度大于0.009 5 g/L時,細胞膜的通透性隨著CTAB濃度的提高而提高。濃度為0.057 0 g/L的CTAB與作用15 min后得到A280的值達到2.05,是0.009 5 g/L時的3倍以上,此時細胞膜的通透性嚴重提高。此外,在相同的CTAB濃度下,CTAB和菌體作用時間由15 min延長至90 min或135 min,A280未見顯著提高,這暗示CTAB對菌體胞外膜通透性的改變在15 min內(nèi)已經(jīng)完成。

    圖1 CTAB的濃度和對菌體的作用時間對上清液A280的影響

    2.2 CTAB對菌體生長和產(chǎn)酸代謝的影響

    不同濃度的CTAB對發(fā)酵過程中的生物量的影響如圖2所示。試驗數(shù)據(jù)表明:在發(fā)酵進行的最初9 h,CTAB的存在對生物量的增長有一定的抑制作用,且隨著CTAB濃度的增加抑制作用增強。這與文獻[12]報道的高濃度的CTAB有一定的殺菌作用是一致的。發(fā)酵進行9 h后,CTAB對生物量增長的抑制作用減弱。這可能是由于生物量的增長使得單位胞外膜所結(jié)合的CTAB的分子數(shù)下降所致。另一方面,當菌外膜結(jié)合適當數(shù)量的CTAB時,細菌胞外膜通透性的提高有助于菌體與環(huán)境進行物質(zhì)交換,很可能促進生物量的提高。發(fā)酵進行12 h后,添加0.009 5 g/L和0.027 0 g/L CTAB的試驗所得生物量達到并略超過空白試驗的生物量水平。此外,當發(fā)酵進行17 h后,4組試驗的微生物的增長都進入穩(wěn)定期,表明CTAB對微生物的生長周期無明顯影響。在0~0.045 0 g/L的CTAB的條件下,發(fā)酵終端穩(wěn)定的OD600值和pH值見圖3,圖3結(jié)果表明:該濃度下CTAB對產(chǎn)酸代謝和最終的生物量無明顯影響。

    圖2 不同濃度的CTAB對發(fā)酵過程中的生物量的影響

    圖3 培養(yǎng)基中不同濃度的CTAB對發(fā)酵終端的pH和OD600的影響

    2.3 CTAB對發(fā)酵產(chǎn)氫過程的影響

    厭氧發(fā)酵所產(chǎn)生的生物氣經(jīng)氣相色譜分析未檢測到CH4和H2S,僅含有H2和CO2兩種氣體。這意味著混合菌中的產(chǎn)甲烷菌和硫酸鹽還原菌,在初始pH為6.0缺乏有機酸的培養(yǎng)基中幾乎沒有生長繁殖。生物氣經(jīng)過堿洗裝置后所得氫氣的含量大于95%。

    發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的氫氣體積隨時間的變化曲線如圖4所示。由圖4可以看出:發(fā)酵的前8~10 h,CTAB對產(chǎn)氫過程有一定的抑制作用,且隨著CTAB濃度的增加抑制作用增強;發(fā)酵進行8~10 h后抑制作用減弱。且當CTAB濃度小于0.027 0 g/L時,產(chǎn)氫速率顯著提高。這與CTAB對混合菌生物量增長的影響規(guī)律一致(見圖2)。產(chǎn)氫發(fā)酵進行28 h后,不同CTAB濃度條件下的產(chǎn)氫過程全部終止,這暗示CTAB對產(chǎn)氫代謝持續(xù)的時間沒有影響。值得一提的是,當CTAB濃度在0~0.027 0 g/L的條件下,發(fā)酵所得累計產(chǎn)氫量隨著CTAB濃度的增加而增加。在0.027 0 g/L的CTAB環(huán)境下,獲得最大的累計產(chǎn)氫量為304 mL,此時產(chǎn)氫效率為13.6 mmol每克木糖,是對照試驗(未添加CTAB)的1.38倍。

    圖4 不同濃度的CTAB條件下累計產(chǎn)氫體積隨發(fā)酵時間的變化

    用優(yōu)化的Logistic模型擬合產(chǎn)氫量隨時間的變化關(guān)系得到較高的相關(guān)性(R2≥0.99)。不同CTAB濃度條件下的擬合值,產(chǎn)氫潛力Pm、最大產(chǎn)氫速率Rm和停滯時間λ列于表1中。從表1中可以看出:當培養(yǎng)基中添加0~0.027 0 g/L CTAB時,累計產(chǎn)氫量、最大產(chǎn)氫速率以及產(chǎn)氫潛力隨著CTAB濃度的增加而增加。進一步提高CTAB的濃度,累計產(chǎn)氫量、最大產(chǎn)氫速率以及產(chǎn)氫潛力均下降。在添加0.027 0 g/L CTAB的條件下得到最大產(chǎn)氫潛力327 mL和最大產(chǎn)氫速率19.57 mL/h,分別較對照試驗提高了45%和44%。這說明通過改變胞外膜通透性能有效促進產(chǎn)氫代謝,這可能與胞內(nèi)氫氣分壓的下降對產(chǎn)氫反應的促進作用和對吸氫反應的抑制作用有關(guān)。然而進一步提高培養(yǎng)基中CTAB的濃度,又表現(xiàn)出對產(chǎn)氫代謝的顯著抑制作用。0.045 0 g/L CTAB的條件下,所得累計產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率分別為0.027 0 g/L CTAB的條件下的54%和60%,而在該濃度條件下CTAB對終端生物量和產(chǎn)酸代謝并無明顯抑制(見圖3)。文獻[13]報道產(chǎn)氣腸桿菌中產(chǎn)氫的關(guān)鍵性酶(氫酶)是膜結(jié)合酶。文獻[14]報道隨著CTAB濃度的增加,生物酶的活性下降。因此,過高濃度的CTAB對產(chǎn)氫過程的負面作用可能是由于氫酶的活性受到高濃度的CTAB的抑制引起的,這有待于進一步研究。

    表1 不同濃度的CTAB 對發(fā)酵過程中的動力學參數(shù)的影響

    另外,CTAB對產(chǎn)氫發(fā)酵的停滯時間也有顯著影響,且隨著CTAB濃度的增加停滯時間增加。在0.045 0 g/L的CTAB條件下,停滯時間由對照試驗的2.33 h增加至7.29 h。CTAB對產(chǎn)氫發(fā)酵的停滯時間的影響與CTAB對生物量增長的影響有關(guān)(見圖2)。

    2.4 化學添加劑強化產(chǎn)氫發(fā)酵的文獻對比

    本文研究得出CTAB是用于暗發(fā)酵產(chǎn)氫的一種有效的化學添加劑。文獻報道的化學添加劑對光發(fā)酵和暗發(fā)酵產(chǎn)氫的影響總結(jié)如表2所示。由表2可以看出:煙酸和MoO2-4對光發(fā)酵產(chǎn)氫過程的強化作用顯著,在適宜濃度的煙酸或者MoO2-4的環(huán)境下,產(chǎn)氫速率的強化倍數(shù)可達到3以上。各種添加劑對暗發(fā)酵過程中產(chǎn)氫速率和累計產(chǎn)氫量的強化倍數(shù)一般都小于2。本研究中CTAB與其他用于暗發(fā)酵的添加劑相比,累計產(chǎn)氫量和產(chǎn)氫速率的強化倍數(shù)相當,但CTAB的用量遠遠小于其他添加劑。

    各種添加劑對產(chǎn)氫過程的作用機理不同。Ni2+,F(xiàn)e2+和MoO2-4是氫酶或者鉬固氮酶的組成成分,所以添加Ni2+,F(xiàn)e2+和MoO24促進了產(chǎn)氫的原因可能與氫酶或者鉬固氮酶活性的提高有關(guān)。添加乳酸對產(chǎn)氫過程的強化可能是由于甲酸和乙醇的代謝途徑向丁酸代謝途徑轉(zhuǎn)換所致[3]。有關(guān)L-胱氨酸的強化機理目前尚不清楚。本研究中CTAB對產(chǎn)氫發(fā)酵的強化作用可能是由于CTAB與胞外膜結(jié)合引起胞外膜溶解而使胞外膜的通透性提高。

    表2 通過化學添加劑強化產(chǎn)氫發(fā)酵的文獻對比

    3 結(jié)論

    本研究通過在培養(yǎng)基中添加微量的CTAB,實現(xiàn)了強化發(fā)酵產(chǎn)氫的目的。CTAB對混合菌胞外膜通透性,對發(fā)酵過程中產(chǎn)氫速率、累計產(chǎn)氫量、生物量增長和產(chǎn)氫停滯時間都有一定程度的影響。

    (1)濃度大于0.009 5 g/L的CTAB溶液可有效提高混合菌菌體胞外膜的通透性。

    (2)在發(fā)酵過程中的前9 h內(nèi),CTAB對混合菌的生長繁殖有一定的抑制作用,但濃度小于0.045 0 g/L的CTAB對發(fā)酵終端的生物量沒有明顯影響;CTAB的存在使得產(chǎn)氫發(fā)酵過程中的停滯時間延長,且隨著CTAB濃度的增加而增加。

    (3)0.095 0~0.027 0 g/L的CTAB可有效地強化混合菌的產(chǎn)氫發(fā)酵過程。并在CTAB濃度為0.027 0 g/L時得到最大產(chǎn)氫效率(13.6 mmol每克木糖)和最大的產(chǎn)氫速率(19.6 mL/h),與對照試驗相比分別提高38%和44%。

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