心理應(yīng)激對(duì)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨細(xì)胞MMP-3和TIMP-3表達(dá)的影響

肖 朋， 黃 旭， 劉海霞， 王 兵

(新疆醫(yī)科大學(xué)1第二附屬醫(yī)院口腔科， 烏魯木齊 830028； 2第五附屬醫(yī)院口腔科， 烏魯木齊 830011)

心理應(yīng)激是機(jī)體在受到各種強(qiáng)烈的刺激因素時(shí)，內(nèi)外環(huán)境超出正常閾值，出現(xiàn)以交感神經(jīng)興奮和垂體腎上腺皮質(zhì)分泌增多為主的一系列神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)，持續(xù)的心理應(yīng)激與疾病有著密切的關(guān)系，對(duì)某些疾病的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸都有著重要的影響[1]。心理應(yīng)激對(duì)顳下頜關(guān)節(jié)也同樣有重要的影響，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，心理應(yīng)激狀態(tài)之下大鼠顳下頜關(guān)節(jié)的組織結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，特別是關(guān)節(jié)軟骨發(fā)生了光澤度以及軟骨層變薄等形態(tài)學(xué)改變[2]。軟骨的合成和降解受到諸如化學(xué)、力學(xué)以及免疫學(xué)等多因素的影響，正常的關(guān)節(jié)軟骨處于一種精妙的合成與分解的動(dòng)態(tài)平衡中。當(dāng)關(guān)節(jié)軟骨受到不利刺激時(shí)，導(dǎo)致軟骨的降解大于合成，此時(shí)軟骨被破壞[3]?；|(zhì)金屬蛋白酶及其抑制劑是維系軟骨合成和降解的重要成分，基質(zhì)金屬蛋白酶-3(Matrix Metalloproteinase-3 ，MMP-3)和金屬蛋白酶組織抑制劑-3(Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-3 ，TIMP-3) 就是其典型代表[4]。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用免疫組化方法，研究大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨中MMP-3和TIMP-3的表達(dá)情況，初步探討心理應(yīng)激對(duì)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨改變的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 48只成年雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量(170±10)g，清潔級(jí)，動(dòng)物及飼料均由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.1.2 動(dòng)物分組和處理 將48只大鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)3 w組、實(shí)驗(yàn)6 w組、實(shí)驗(yàn)刺激去除后6 w組(恢復(fù)組)和空白對(duì)照組，每組12只。對(duì)3個(gè)實(shí)驗(yàn)組大鼠分別施加足底電擊、制動(dòng)、氣候箱和食物誘惑4種刺激方式，建立大鼠心理應(yīng)激動(dòng)物模型，并對(duì)動(dòng)物模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，對(duì)照組不施加任何刺激。分別在3、6 w時(shí)間點(diǎn)處死實(shí)驗(yàn)3、6 w組大鼠，恢復(fù)組大鼠先刺激6 w后，停止刺激，正常環(huán)境飼養(yǎng)6 w后處死，對(duì)照組與恢復(fù)組大鼠一同處死。采用乙醚麻醉下頸椎脫臼處死方法。

1.1.3 動(dòng)物取材與標(biāo)本處理 將動(dòng)物處死后立即進(jìn)行解剖，顳下頜關(guān)節(jié)所取標(biāo)本結(jié)構(gòu)包括關(guān)節(jié)盤、髁狀突和包繞髁突頸部的部分關(guān)節(jié)囊。將標(biāo)本固定、脫鈣，常規(guī)蠟塊包埋，4 μm切片。切片時(shí)沿關(guān)節(jié)頭矢狀方向從髁突中1/3切開，制作切片中包括關(guān)節(jié)盤、關(guān)節(jié)軟骨、關(guān)節(jié)骨質(zhì)、骨髓腔和關(guān)節(jié)囊髁頸部附著轉(zhuǎn)折處內(nèi)面滑膜。

1.2免疫組化方法采用免疫組織化學(xué)鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化酶連接(S-P)法，按試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作。抗MMP-3抗體、抗TIMP-3抗體、SP試劑盒、DAB顯色劑均購(gòu)自北京鼎國(guó)生物科技有限公司。MMP-3和TIMP-3在髁突軟骨細(xì)胞出現(xiàn)棕色或棕黃色染色為陽(yáng)性，陽(yáng)性細(xì)胞及間質(zhì)著色水平明顯高于背景。計(jì)數(shù)評(píng)判方法參考蘇書娟等[5]采用的方法，隨機(jī)計(jì)數(shù)3個(gè)400倍視野下細(xì)胞總數(shù)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞百分率，依陽(yáng)性率高低共分為4個(gè)等級(jí)：陰性“-”(無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞)，弱陽(yáng)性“+”(陽(yáng)性細(xì)胞<25%)，陽(yáng)性“++”(陽(yáng)性細(xì)胞25%～50%)，強(qiáng)陽(yáng)性“+++”(陽(yáng)性細(xì)胞>50%)。由病理科醫(yī)師盲法協(xié)助讀片并報(bào)告、采圖。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，進(jìn)行多個(gè)樣本的等級(jí)秩和檢驗(yàn)，即H檢驗(yàn)，組間多重比較采用Z檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨細(xì)胞MMP-3的表達(dá)情況MMP-3在4組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)中均出現(xiàn)不同程度棕色或棕黃色顆粒狀著色，著色水平明顯高于背景非特異染色。其中尤以實(shí)驗(yàn)6 w組細(xì)胞出現(xiàn)陽(yáng)性染色多，細(xì)胞陽(yáng)性強(qiáng)度達(dá)到“++”～ “+++”，實(shí)驗(yàn)3 w組和恢復(fù)組細(xì)胞陽(yáng)性染色數(shù)量遞減，對(duì)照組細(xì)胞陽(yáng)性染色數(shù)量最少，陽(yáng)性強(qiáng)度為“-”～ “+”，見圖1～4。4組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨細(xì)胞中MMP-3表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Hc=17.774，P=0.001)。實(shí)驗(yàn)3 w組和實(shí)驗(yàn)6 w組中MMP-3表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見表1。

表1 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨細(xì)胞MMP-3表達(dá)情況/只

2.2大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨細(xì)胞TIMP-3的表達(dá)情況TIMP-3在4組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的胞質(zhì)和細(xì)胞間質(zhì)中亦出現(xiàn)不同程度棕色或棕黃色顆粒狀著色，且著色水平明顯高于背景非特異染色。其中尤以恢復(fù)組細(xì)胞出現(xiàn)陽(yáng)性染色多，細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度達(dá)到“++”～ “+++”，實(shí)驗(yàn)6 w和實(shí)驗(yàn)3 w細(xì)胞陽(yáng)性染色數(shù)量遞減，對(duì)照組細(xì)胞陽(yáng)性染色數(shù)量最少，陽(yáng)性表達(dá)強(qiáng)度為“-”～ “+”，見圖5～8。4組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨細(xì)胞中TIMP-3表達(dá)強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Hc=8.854，P=0.031)?；謴?fù)組TIMP-3表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，見表2。

表2 大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨細(xì)胞TIMP-3表達(dá)情況/只

圖1 對(duì)照組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMP-3表達(dá)(×400)

圖2 刺激3 w組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMP-3表達(dá)(×400)

圖3 刺激6 w組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMP-3表達(dá)(×400)

圖4 恢復(fù)組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMP-3表達(dá)(×400)

圖5 對(duì)照組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TIMP-3表達(dá)(×400)

圖6 刺激3 w組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TIMP-3表達(dá)(×400)

圖7 恢復(fù)組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TIMP-3表達(dá)(×400)

圖8 刺激6 w組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞TIMP-3表達(dá)(×400)

3 討論

關(guān)節(jié)軟骨屬于透明軟骨，由致密結(jié)締組織的膠原纖維構(gòu)成，表面光滑，有光澤。軟骨細(xì)胞由淺層向深層逐漸由扁平樣至橢圓或圓形的細(xì)胞組成，這些軟骨細(xì)胞維持關(guān)節(jié)軟骨的正常代謝。

基質(zhì)金屬蛋白酶(MatrixMetalloproteinases，MMPs)是20世紀(jì)末發(fā)現(xiàn)的一組蛋白酶家族，其中包括膠原酶、明膠酶、間質(zhì)溶解素和膜型基質(zhì)金屬蛋白酶4種類型，目前已發(fā)現(xiàn)的至少有25個(gè)成員，在細(xì)胞外基質(zhì)和骨質(zhì)的穩(wěn)定以及炎癥性溶骨性疾病中起到了重要的作用[6]。

MMP-3為間質(zhì)溶解素的一種，又稱基質(zhì)裂解素，主要來(lái)源于活化的結(jié)締組織細(xì)胞，具有裂解纖維粘連蛋白、蛋白聚糖、明膠、層粘連蛋白、彈性蛋白及IV、IX、X型膠原的功能。MMP-3是目前公認(rèn)的與骨關(guān)節(jié)病關(guān)系密切的基質(zhì)金屬蛋白酶之一，不僅能夠降解軟骨細(xì)胞外基質(zhì)中的主要成分，而且可以促使破骨細(xì)胞的遷移和粘附，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)降解破壞[7]。MMP-3在風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和骨反應(yīng)性關(guān)節(jié)炎患者的骨和軟骨的破壞過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[8]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)3w組、實(shí)驗(yàn)6w組MMP-3表達(dá)陽(yáng)性強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組和恢復(fù)組，MMP-3表達(dá)強(qiáng)度的高低與大鼠顳下頜關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)病變程度趨勢(shì)基本一致，即在大鼠顳下頜髁突軟骨出現(xiàn)粗糙、變薄、裂隙等[2]組織結(jié)構(gòu)變化處MMP-3表達(dá)陽(yáng)性率高，此結(jié)果顯示MMP-3過(guò)表達(dá)可能與顳下頜關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)破壞有關(guān)。

金屬蛋白酶組織抑制劑(TissueInhibitorofMetalloproteinase，TIMPs)的作用是在MMP的激活過(guò)程中，與MMP的中間體結(jié)合，從而抑制MMP的激活，使其濃度降低，從而阻止了細(xì)胞外基質(zhì)的降解，TIMPs是軟骨組織中MMPs活性最重要的調(diào)節(jié)因素[9]。MMPs與TIMPs之間的比例失衡狀態(tài)被認(rèn)為是軟骨基質(zhì)破壞的重要因素[10]。MMPs與TIMPs平衡可系統(tǒng)調(diào)控成骨細(xì)胞分化與破骨細(xì)胞的骨吸收，從而完成病變骨質(zhì)的修復(fù)[11]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示恢復(fù)組TIMP-3表達(dá)強(qiáng)度明顯高于對(duì)照組，恢復(fù)組TIMP-3高表達(dá)，與恢復(fù)組大鼠顳下頜關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)修復(fù)性改變一致，表明TIMP-3可能在軟骨組織修復(fù)中發(fā)揮了重要作用。此外，實(shí)驗(yàn)3w組和實(shí)驗(yàn)6w組MMP-3的表達(dá)較高，而TIMP-3在以上兩組中的表達(dá)亦稍高，表明大鼠髁突軟骨細(xì)胞在發(fā)生組織結(jié)構(gòu)破壞的同時(shí)，存在一定的組織修復(fù)，但MMP-3發(fā)揮的破壞作用大于TIMP-3的修復(fù)作用，破壞占據(jù)主要地位。Gomes等[12]發(fā)現(xiàn)在高轉(zhuǎn)移性乳腺癌細(xì)胞中，TGF-β1細(xì)胞因子通過(guò)MAPKs信號(hào)通道作用于基質(zhì)金屬蛋白酶和金屬蛋白酶組織抑制劑之間的平衡，即細(xì)胞外基質(zhì)破壞與抗破壞之間的平衡，上調(diào)ERK1/2信號(hào)通路可增加金屬蛋白酶組織抑制劑的表達(dá)，表現(xiàn)為抗破壞細(xì)胞外基質(zhì)作用增強(qiáng)。所以，今后或許可以尋找一種通過(guò)調(diào)控此途徑的方法來(lái)減弱心理應(yīng)激對(duì)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)髁突軟骨的破壞作用。

綜上所述，在心理應(yīng)激刺激之下，大鼠的顳下頜關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)內(nèi)發(fā)生了代謝性的紊亂，MMP-3和TIMP-3分別在髁突軟骨的破壞和修復(fù)中發(fā)揮了一定的作用，但應(yīng)激與髁突軟骨破壞和修復(fù)之間的作用機(jī)制尚未明了。大鼠在應(yīng)激作用下，機(jī)體可能是通過(guò)一些細(xì)胞因子和細(xì)胞通道來(lái)調(diào)控MMPs和TIMPs之間的平衡，進(jìn)行此方面的研究或許能為應(yīng)激作用下髁突軟骨細(xì)胞變化的作用機(jī)制提供支持。

參考文獻(xiàn):

[1] Ball TM. Cortisol circadian rhythma and stress responses in infants an risk of allergic disease[J]. Neuroimmunomodulation, 2006,13(5):294-300.

[2] 肖朋,張麗,侯敏,等.心理應(yīng)激對(duì)大鼠顳下頜關(guān)節(jié)組織結(jié)構(gòu)的影響[J].科技導(dǎo)報(bào),2010，28(10):32-36.

[3] 馬緒臣. 顳下頜關(guān)節(jié)病的基礎(chǔ)和臨床[M]. 2版, 北京:人民衛(wèi)生出版社, 2004:11-13.

[4] Vo NV, Sowa GA, Kang JD, et al. Prostaglandin E2 and prostaglandin F2a differentially modulate matrix metabolism of human nucleus pulposus cells[J]. J Orthop Res, 2010, 28(10):1259-1266.

[5] 蘇書娟,邢魯奇,陳登庭,等.MMP-2MMP-9在乳腺導(dǎo)管癌中表達(dá)及意義[J]. 中國(guó)公共衛(wèi)生,2011,27(3):268-270.

[6] 張宏偉, 陳乾美. 基質(zhì)金屬蛋白酶-3、白介素-8在中耳膽脂瘤上皮中的表達(dá)[J]. 實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志, 2010, 26(22):4145-4148.

[7] 范智斌,王峻,胡彥君,等.磁共振成像和血清基質(zhì)金屬蛋白酶-3對(duì)強(qiáng)直性脊柱炎骶髂關(guān)節(jié)病變的診斷價(jià)值[J].中國(guó)藥物與臨床,2012,12(10):1292-1293.

[8] Kane D,Jensen L,Grehan S,et al.Quantitation of metalloproteinase gene expression in rheumatoid and psoriatic arthritis synovial tissue distal and proximal to the cartilagepannus junction[J].J Rheumatol ,2004,31(7):1274-1280.

[9] Rhee JS,Diaz R,Korets L,et al.TIMP-1 alters susceptibility to carcinogenesis[J]. Cancer Res,2004,64(8):952-961.

[10] 王建忠,武永剛,王坤正.激素性股骨頭壞死患者骨組織MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TIMP-2蛋白的表達(dá)[J]. 中華關(guān)節(jié)外科雜志:電子版, 2012, 6(1):91-96.

[11] Sasaki K,Takagi M,Konttinen YT,et al.Upregulation of matrix metalloproteinase MMP-1 and its activator MMP-3 of human osteoblast by uniaxial cyclic stimulation[J].J Biomed Mater Res B Appl Biomater,2007,80:491-498.

[12] Gomes LR, Terra LF, Wailemann RA, et al. TGF-β1 modulates the homeostasis between MMPs and MMP inhibitors through p38 MAPK and ERK1/2 in highly invasive breast cancer cells[J]. BMC Cancer, 2012,12(26):1471-1486.