HPLC法測定牛至中迷迭香酸的含量

李 明， 李建光, 王東東， 丁文歡， 周曉英

(新疆醫(yī)科大學1第六附屬醫(yī)院藥劑科， 烏魯木齊 830002, 2藥學院, 3中醫(yī)學院, 烏魯木齊 830011)

牛至為唇形科植物牛至(OriganumvulgareL.)的干燥全草，維吾爾語名為“尖比力”， 別名通常有土香薷、小葉薄荷、止痢草等，夏秋二季花開時采收，除去雜質(zhì)，曬干。維吾爾醫(yī)認為牛至能消散寒氣，開通濕阻，清滌異常體液，利尿通經(jīng)，增強營養(yǎng)吸收，用于粘稠異常體液性咳喘、感冒、頭痛、脈絡(luò)閉阻性胸悶氣短、形體消瘦、心煩神疲、食欲不振、尿少肢腫[1]。牛至在新疆主要分布于天山、阿勒泰山、準噶爾西部的山地草甸、林緣、河谷、亞高山草原及河谷[2]，以及河南、甘肅、湖北、陜西等省區(qū)，國外主要分布于地中海地區(qū)、中亞、北非、北美等地。牛至性涼，味辛，無毒，有清熱解表、利水消腫的功效，主治中暑、感冒、頭痛身痛、急性胃腸炎、腹痛吐瀉、水腫等[3]。

牛至含有揮發(fā)油類、黃酮類、三萜類、有機酸類等化學成分[4-5]。薄層色譜定性實驗表明，牛至中含有迷迭香酸，且含量較高。迷迭香酸具有多方面的藥理作用，如清除自由基、抗炎和免疫調(diào)節(jié)、抗血栓和抗血小板凝集、抗病毒和抗菌、抑制腎小球系膜細胞的增殖、抗抑郁等[6]。本研究以迷迭香酸為指標成分，參考文獻[7-8]，采用高效液相色譜法測定其在牛至中的含量，為提高牛至的藥品標準提供定量的數(shù)據(jù)支持。

1 儀器與試藥

1.1儀器高效液相色譜儀LC-6AD、CBM-20A色譜工作站、SPD-20A型紫外檢測器、 SIL-20A型自動進樣器、CTO-10ASvp型柱溫箱(日本島津公司)，XS105型電子天平(德國梅特勒-托利多公司)。

1.2樣品與試劑甲醇為色譜純，其他均為分析純，水為娃哈哈飲用純凈水，迷迭香酸對照品(sigma-ALDRICH，批號：CFAE-536954-5G)。牛至全株采集于新疆昌吉、伊犁地區(qū)，由新疆維吾爾自治區(qū)中醫(yī)醫(yī)院李永和主任藥師鑒定為唇形科植物牛至(OriganumvulgareL.)，陰干，粉碎，即得供試樣品。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱: Kromasil C18柱(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，流動相：甲醇-1.5%乙酸水(38∶62)，檢測波長330 nm，柱溫25℃，流速1.0 mL/min。在上述色譜條件下，迷迭香酸與供試品中其他組分色譜峰可達到基線分離，分離度良好，迷迭香酸峰理論塔板數(shù)不低于2 000，迷迭香酸及牛至供試樣品色譜圖見圖1。

A: 迷迭香酸對照品;

B:牛至供試樣品(a:迷迭香酸對照品)

2.2對照品溶液的制備精密稱取11.07 mg迷迭香酸對照品，用甲醇定容于25 mL棕色量瓶中，分別取1.5、3、4.5、6、7.5 mL，用甲醇定容于10 mL棕色量瓶中，制成一系列不同濃度的溶液。

2.3供試品溶液的制備精密稱定干燥牛至藥材粉末0.5 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，加入25 mL甲醇，稱定重量，浸泡30 min，超聲提取(功率150 W, 頻率60 KHz)30 min，取出放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得供試品溶液。

2.4線性關(guān)系考察精密吸取迷迭香酸對照品溶液5 μL進樣分析，以對照品濃度(X，mg/mL)為橫坐標，以峰面積積分值(Y)為縱坐標，繪制標準曲線，得迷迭香酸線性回歸方程為Y=13 602 333.63X-52 022.80(r=0.999 9)，結(jié)果表明，迷迭香酸進樣量在0.332 1～1.660 5 μg范圍內(nèi)，峰面積與進樣量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.5精密度試驗精密吸取迷迭香酸對照品溶液5 μL，連續(xù)進樣6 次，結(jié)果齊迷迭香酸峰面積RSD值為1.15%，表明精密度較好。

2.6穩(wěn)定性試驗取同一牛至供試品溶液(3號樣)，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h進樣5 μL測定，結(jié)果迷迭香酸峰面積的RSD值為2.19 %，表明供試品溶液在24 h內(nèi)基本穩(wěn)定，峰面積沒有在考察時間內(nèi)呈現(xiàn)下降趨勢。

2.7重復性試驗精密稱取牛至藥材粉末6 份(6號樣)，按“供試品溶液的制備”項下方法制成供試液，并在上述色譜條件下進樣5 μL，測定迷迭香酸峰面積，計算含量。結(jié)果供試品中迷迭香酸含量的RSD值為1.69 %，表明實驗方法的重復性較好。

2.8加樣回收率試驗分別精密稱取6份已知含量牛至藥材粉末(6號樣)0.25 g，分別置于50 mL具塞錐形瓶中，精密稱取迷迭香酸對照品21.91 mg置25 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度。每個具塞錐形瓶中分別準確對照品4 mL和甲醇21 mL，按“供試品溶液的制備”項下方法制成供試液，在上述色譜條件下進樣5 μL測定，結(jié)果平均回收率為98.96%，RSD=1.09%，見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果

2.9樣品含量測定精密吸取供試品溶液5 μL分別注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定，每樣平行測定5份，計算樣品中迷迭香酸的含量，結(jié)果10個產(chǎn)地的迷迭香酸含量為8.13～15.74 mg/g，見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果(n=5)

3 結(jié)論

牛至油是牛至的主要有效成分，具有抑菌殺菌作用，近年來多用于飼料添加劑。但本實驗測定的10批樣品均產(chǎn)自新疆，揮發(fā)油提取實驗結(jié)果表明，揮發(fā)油含量極少，不適宜作為提高藥品標準的定量指標；而有機酸類成分迷迭香酸在所有批次樣品中均有檢出，含量為8.13～15.74 mg/g，且具有顯著的生物活性，故將迷迭香酸定為定量檢測指標。

高效液相色譜法測定牛至中的迷迭香酸，樣品處理簡單，分離度較好，測定迅速，為牛至藥材的開發(fā)提供依據(jù)。

參考文獻:

[1] 國家藥典委員會. 中華人民共和國衛(wèi)生部藥品標準:維吾爾藥分冊[S].烏魯木齊:新疆科技衛(wèi)生出版社, 1999.

[2] 新疆植物志編輯委員會. 新疆植物志:第四卷[M]. 烏魯木齊:新疆科學技術(shù)出版社, 2004:333．

[3] 孫麗娟,劉紅兵,許漢林,等.湖北產(chǎn)牛至藥材中香荊芥酚和麝香草酚的含量測定[J].中藥材, 2005, 28(7):562-563.

[4] 李俊杰,,李蓉濤.牛至的研究現(xiàn)狀[J].光譜實驗室, 2013, 30(1):171-175.

[5] 孫麗娟,劉紅兵,范文乾,等. 牛至的化學成分研究(I) [J].中草藥, 2007, 38(12):1782 -1785.

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[7] 方穎,劉焱文.高效液相色譜法測定不同產(chǎn)地牛至藥材中對-聚傘花素的含量[J].中國醫(yī)院藥學雜志, 2006, 26(4):428-430.

[8] 關(guān)新莉,李潔,王東東,等. HPLC 法測定異葉青蘭中迷迭香酸的含量[J].新疆醫(yī)科大學學報, 2013, 36(9):1284-1286.