Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ?qū)Π螂滓菩屑?xì)胞癌T24細(xì)胞生長、增殖的影響

龍永其, 陽新華, 諶 磊, 楊羅艷, 歐陽曙光, 劉勁戈, 劉文進

(1湖南省株洲市中心醫(yī)院泌尿外科, 湖南 株洲 412000; 2中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院泌尿外科, 長沙 410008; 3湖南計劃生育委員會研究所, 長沙 410000)

Src是最早報道的癌基因，c-Src在許多上皮和非上皮惡性腫瘤都出現(xiàn)過度表達和活性異常，c-Src的蛋白產(chǎn)物在眾多信號傳導(dǎo)通路中起著關(guān)鍵作用，影響著細(xì)胞的增殖、分化、遷移和存活，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移及預(yù)后密切相關(guān)， Src蛋白在調(diào)控細(xì)胞的生長(生存和增生)、粘附、運動和細(xì)胞信號傳導(dǎo)等方面發(fā)揮重要作用。Src蛋白可以通過生長因子受體與細(xì)胞外的生長因子相互作用，或者通過整和素與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，通過信號傳導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞周期，影響細(xì)胞增殖。其作用一是激活Ras/MEK/ERK/cyclin/cdks通路，促進G1期到S期的轉(zhuǎn)換;二是激活STAT3/c-Myc，促進有絲分裂。在這2個信號傳導(dǎo)通路中，活化的Src蛋白可以使p38 MAPK三肽區(qū)的蘇氨酸、酪氨酸雙磷酸化而激活。激活后細(xì)胞漿中的p38 MAPK即移位到細(xì)胞核, 影響細(xì)胞內(nèi)多種基因的轉(zhuǎn)錄、蛋白的合成及細(xì)胞表面受體表達和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致細(xì)胞生長、增殖、分化發(fā)生變化，從而抑制腫瘤發(fā)生、增長、侵襲和轉(zhuǎn)移。

本研究使用半定量RT-PCR法檢測加入Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ后的人膀胱癌細(xì)胞T24各濃度組的c-Src、p38MAPK基因表達的變化情況，使用Western blot檢測Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ后處理T24細(xì)胞內(nèi)的c-Src蛋白(包括其磷酸化類型與非磷酸化類型)表達情況。探討Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ?qū)rc蛋白及其下游信號的作用,論證Src蛋白作為膀胱移行細(xì)胞癌分子靶向治療的潛在靶點的可能性。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器人膀胱癌T24細(xì)胞購至上海細(xì)胞典藏物中心，Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ: Src Kinase Inhibitor II(Cat. No. 567806),購自Merck Calbiochem 公司。

1.2方法

1.2.1 引物設(shè)計 根據(jù)c-Src， p38MAPK、β-actin的mRNA序列(genebank序列號NM-005417、NM-004360、NM-139012)，應(yīng)用在線引物設(shè)計軟件primer3設(shè)計相關(guān)引物(表1)。

1.2.2 方法 合成第一鏈cDNA后行PCR擴增,電泳及分析結(jié)果,PCR產(chǎn)物測序及BLAST比較分析-制備標(biāo)本總蛋白,制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE),將PVDF膜上的目的蛋白條帶在Gel DoC 2000 凝膠成像系統(tǒng)中進行分析處理，用目的基因與內(nèi)參照β-actin的光密度比值來衡量表達情況。

表1 c-Src、 P38MAPK、β-actin引物設(shè)計

2 結(jié)果

2.1半定量RT-PCR法檢測Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ?qū)24細(xì)胞c-SrcmRNA、P38mRNA的表達加入Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ后，人膀胱癌細(xì)胞T24各濃度組的c-Src mRNA的表達比值(c-Src/β-actin)在0、0.2、1.0、5.0 μmol/mL濃度組分別為(0.750±0.030)、(0.680±0.020)、(0.670±0.042)、(0.065±0.030)，顯示人膀胱癌細(xì)胞T24的c-Src基因的mRNA表達水平在加入Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ后有下調(diào)，同時顯示人膀胱癌細(xì)胞T24的c-Src基因在mRNA表達水平上隨加入Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ濃度的增長表達呈逐漸降低趨勢，但是表達下降不明顯，各濃度組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)，見表2。

表2 半定量RT-PCR法檢測Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ?qū)24細(xì)胞c-SrcmRNA，P38mRNA的表達

2.2加入Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ后的人膀胱癌細(xì)胞T24各濃度組的p38mRNA的表達比值p38/β-actin在0、0.2、1.0、5.0 μmol/mL濃度組分別為(0.913±0.031)、(0.920±0.030)、(0.657±0.056)、(0.383±0.045)，顯示人膀胱癌細(xì)胞T24的p38基因的mRNA表達水平在加入Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ后有下調(diào)，同時顯示人膀胱癌細(xì)胞T24的p38基因在mRNA表達水平上隨加入Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ濃度的增長表達呈逐漸下調(diào)趨勢，并且0.2、1.0、5.0 μmol/mL濃度組與0 μmol/mL濃度組相比表達明顯減少，組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，見表2。

2.3T24細(xì)胞內(nèi)的c-Src蛋白表達結(jié)果T24細(xì)胞內(nèi)c-Src基因在蛋白表達水平上其磷酸化類型隨Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ濃度的增高表達逐漸下降，并且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系，T24細(xì)胞內(nèi)c-Src基因在蛋白表達水平上其非磷酸化類型隨Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ濃度的增高表達無明顯變化，與劑量無關(guān)。各組細(xì)胞c-Src蛋白表達比值分別為：磷酸化組：0、1.0、5.0 μmol/mL組表達比值分別為(0.737±0.044)、(0.423±0.038)、(0.234±0.045)，1.0 μmol/mL及5.0 μmol/mL組明顯低于對照組(P<0.05)，10 μmol/mL及20 μmol/mL組間比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。非磷酸化組0、1.0、5.0 μmol/mL組表達比值分別為(0.805±0.019)、(0.777±0.028)、 (0.826±0.048)，組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表3 Western blot檢測不同濃度Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ處理后T24細(xì)胞c-Src蛋白的表達

注：與0 μmol/mL組比較，△P<0.05； 與1.0 μmol/mL比較，△P<0.05。

3 討論

Src蛋白可以通過生長因子受體與細(xì)胞外的生長因子相互作用，或者通過整和素與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用，通過數(shù)個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控細(xì)胞周期，影響細(xì)胞增殖。Src蛋白在膀胱移行細(xì)胞癌的作用包括以下幾個方面：(1)激活Ras/MEK/ERK/cyclin/cdks通路，促進G1期到S期的轉(zhuǎn)換；(2)激活STAT3/c-Myc，促進有絲分裂[1-4]；(3)Src蛋白能激活P13-K/Akt通路，抑制細(xì)胞調(diào)亡，調(diào)節(jié)細(xì)胞存活[1-6]；(4)Src蛋白可以通過p 190 RhoGAP和錨著斑激酶的磷酸化調(diào)控細(xì)胞骨架的重組，調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和運動[1-2]。

本研究首先運用半定量RT-PCR檢測加入Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ后的人膀胱癌細(xì)胞T24各濃度組的c-Src基因的表達,發(fā)現(xiàn)人膀胱癌細(xì)胞T24的c-Src基因的mRNA表達水平在加入Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ后雖有下調(diào)，但是表達下降不明顯，各濃度組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.01)。再設(shè)計應(yīng)用選擇性Src蛋白酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ后使用Western blot法分別檢測T24細(xì)胞內(nèi)的Src蛋白的磷酸化類型與非磷酸化類型，蛋白凝膠電泳分析結(jié)果顯示： T24細(xì)胞內(nèi)c-Src基因在蛋白表達水平上其磷酸化類型(即活化型)隨Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ濃度的增高表達逐漸下降，并且呈劑量-效應(yīng)關(guān)系；而其非磷酸化類型則不被Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ所抑制。因此，認(rèn)為Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ能通過競爭Src蛋白磷酸化位點，使其不能激活，導(dǎo)致下游的細(xì)胞傳導(dǎo)途徑失活,使得T24細(xì)胞增殖得到抑制，遷移能力消弱。認(rèn)為Src蛋白具有作為膀胱移行細(xì)胞癌分子靶向治療的潛在靶點的可能性。

細(xì)胞凋亡是在特定時空中發(fā)生的受機體嚴(yán)密調(diào)控的細(xì)胞“自殺”現(xiàn)象。誘導(dǎo)凋亡的因素能啟動細(xì)胞內(nèi)的一系列反應(yīng)，最終導(dǎo)致雙位點特異激酶MAPK/EPK激酶磷酸化激活p38 通路，再移位于相應(yīng)的轉(zhuǎn)錄因子,啟動基因轉(zhuǎn)錄。 絲裂原活化蛋白激酶(Mitogen-Activated Protein Kinase, MAPK)是細(xì)胞內(nèi)一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，包括ERKl/2、JNK和p38，激活的MAPK家族可誘導(dǎo)許多重要應(yīng)激蛋白的生成，再作用于相同或不同的靶蛋白，產(chǎn)生復(fù)雜的生物學(xué)作用。p38是MAPK家族的重要成員，也是MAPK家族中目前被研究得最為廣泛的一員。研究己經(jīng)發(fā)現(xiàn)， p38蛋白主要在細(xì)胞外環(huán)境發(fā)生變化時被激活，主要通過影響caspase家族上游和下游蛋白來調(diào)控細(xì)胞的凋亡進程，并且可以通過下調(diào)cyclin Dl和CDK4來阻止細(xì)胞從Gl期向S期過渡[7-8]。

Src蛋白可以激活Ras/MEK/ERK/cyclin/cdks通路和STAT3/c-Myc 2個信號通路[1-4]。在這2個信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中, 活化的Src蛋白可以使p38 MAPK三肽區(qū)的蘇氨酸、酪氨酸雙磷酸化而激活。激活后細(xì)胞漿中的p38 MAPK即移位到細(xì)胞核, 影響細(xì)胞內(nèi)多種基因的轉(zhuǎn)錄、蛋白的合成及細(xì)胞表面受體表達和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致細(xì)胞生長、增殖、分化變化，抑制腫瘤發(fā)生、增長、侵襲和轉(zhuǎn)移[9-10]。

p38在凋亡中至少通過以下途徑調(diào)控凋亡:(1)增強c-myc表達。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后的Hela細(xì)胞、MKK6被激活,途徑下游的p38 作用可提高內(nèi)部核糖體進入位點介導(dǎo)的c-myc基因翻譯水平,c-myc此時表現(xiàn)抑癌基因功能,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11];(2)磷酸化p53。用紫外線照射人乳腺癌細(xì)胞系MCF-7細(xì)胞時,p38 發(fā)生活化,進而使p53的第33和46位絲氨酸發(fā)生磷酸化,誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,阻止p38 的活化則可減少第33、34和15位絲氨酸磷酸化,消弱紫外線誘導(dǎo)的凋亡[12]。(3)參與Fas/Fasl介導(dǎo)的凋亡。在誘導(dǎo)體內(nèi)及培養(yǎng)的胰腺癌細(xì)胞凋亡時,檢測到Fas/Fasl的表達,同時亦可見p38的活性增強,提示Fas介導(dǎo)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有p38通路參與[13]。(4)激活c-jun和c-fos。c-jun和c-fos形成異二聚體激活蛋白1,Ras和MAPK參與對激活蛋白1的激活[14]。(5)誘導(dǎo)Bax轉(zhuǎn)位。在NO通過刺激Bax流入線粒體而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡的過程中,p38 的活化起到關(guān)鍵作用[15]。(6)p38 可增強TNF-α表達,進而TNF-α活化p38 誘導(dǎo)凋亡。LPS通過磷酸化激活p38,再通過轉(zhuǎn)錄因子而增加TNF-α基因的轉(zhuǎn)錄活性,這是中毒性休克時TNF-α生成增加的機制。此外,p38 促進凋亡或抑制凋亡與p38 激活的性質(zhì)有關(guān),如短期p38的激活可引起造血腫瘤細(xì)胞SKT6分化,而長時間的激活則可促進其凋亡;在TNF-α處理的中性粒細(xì)胞中,早期p38的激活可延遲凋亡,而晚期p38的激活可加速凋亡[16]。Src蛋白經(jīng)磷酸化激活后可以通過調(diào)控ERK1/2和p38表達，直接和間接地阻止或減少T24細(xì)胞凋亡的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn)人膀胱癌細(xì)胞T24的p38基因的mRNA表達水平在加入Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ后有下調(diào)，其下調(diào)程度上隨加入Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ濃度的增長而增長，推測可能為Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ可以特異性地阻止Src蛋白磷酸化后阻斷其下游的Ras/Raf/MEK/MAPK(ERK1/2或p38)通路和ERK1/2和p38信號通道，調(diào)控ERK1/2和p38表達，從而直接和/或間接地誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡的發(fā)生。

Src蛋白還可以通過p38激酶的磷酸化調(diào)控細(xì)胞骨架的重組，調(diào)節(jié)細(xì)胞粘附和運動。p38被磷酸化激活后,可轉(zhuǎn)而激活多種轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白及酶類等不同底物來調(diào)節(jié)多種細(xì)胞生理過程。MAPK激活蛋白激酶2被p38磷酸化激活后，能通過激活低分子量熱休克蛋白(small heat shock protein,sHSP27)來介導(dǎo)細(xì)胞骨架重塑。研究發(fā)現(xiàn)p38的另一個下游底物——p38調(diào)節(jié)/激活蛋白激酶(p38 regulated/activated protein kinase,PRAK)在被p38磷酸化激活后也能激活HSP27，說明p38信號通路對細(xì)胞骨架具有重要調(diào)控作用[17]。細(xì)胞遷移過程實際上就是一個細(xì)胞骨架發(fā)生周期性變化的過程,而p38參與細(xì)胞骨架重塑調(diào)控也就參與細(xì)胞遷移的調(diào)節(jié)[18-19]。

p38可以激活其下游激酶MK2從而激活HSP27。而Singh等[20]研究表明,MK2可與肌動蛋白相關(guān)蛋白2/3 (actin-related protein 2/3,Arp2/3)復(fù)合體中的一個亞單位p16相互作用，而該復(fù)合體在肌動蛋白的核化和裝配中具有至關(guān)重要的作用。因此MK2可能通過與p16的相互作用來介導(dǎo)細(xì)胞遷移。本研究發(fā)現(xiàn)在p38基因敲除的細(xì)胞中，PDGF誘導(dǎo)的細(xì)胞遷移被阻斷。說明p38確實在細(xì)胞遷移過程中起作用。推測可能為Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ可以特異性地阻止Src蛋白磷酸化后阻斷ERK1/2和p38信號通道，向下調(diào)控p38表達，從而抑制或減弱人膀胱癌T24細(xì)胞的遷移/侵襲/轉(zhuǎn)移的能力。因此認(rèn)為Src酪氨酸激酶抑制劑Ⅱ可以通過影響其下游的Ras/Raf/MEK/MAPK(ERK1/2或p38)通路和ERK1/2和p38細(xì)胞信號傳導(dǎo)通路，下調(diào)p38表達，不僅直接和間接地誘導(dǎo)T24細(xì)胞凋亡，而且可以阻止或減少T24細(xì)胞的遷移、擴散和穿膜侵襲的發(fā)生。

參考文獻：

[1] Frame MC. Src in Cancer:deregulation and Consequences for cell behaviour[J]. Biochim Biophys Acta,2002,1602(2):114-130.

[2] Abram CL, Courtneidge SA. Src family tyrosine kinases and growth factor signaling[J]. Exp Cell Res, 2000, 254(1):1-13.

[3] Riley D, Carragher NO, Frame MC, et al. The mechanism of cell cycle regulation by v-Src[J]. Oncogene, 2001, 20(42):5941-5950.

[4] Bowman T, Broome MA, Sinibaldi D, et al. Stat3-mediated Myc expression is required for Src transformation and PDGF-induced mitogenesis[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2001, 98(13):7319-7324.

[5] Alioua A, Mahajan A, Nishimaru K, et al. Coupling of c-Src to large conductance voltage- and Ca2+-activated K+channels as a new mechanism of agonist-induced vasoconstriction[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2002, 99(22):14560-14565.

[6] Reddy EP, Korapapi A, Chaturvedi P, et al. IL-3 signaling and the role of Src kinases,JAKs and STATs:a convert liaison unveiled[J]. Oncogene,2000, 19(21):2532-2547.

[7] Johnson GL,Lapadat R.Mitogen-activated protein kinase pathways mediated by ERK, JNK, and p38 protein kinases[J]. Science, 2002, 298(560):1911-1912.

[8] Cardone MH, Salvesen GS, Widmann C, et al. The regulation of anoikis:MEKK-1 activation requires cleavage by caspases[J]. Cell, 1997, 90(2):315-323.

[9] Obata T, Brown GE, Yaffe MB. MAP kinase pathways activated by stress:the p38 MAPK pathway[J]. Crit Care Med, 2000, 28(4 Suppl):67-77.

[10] Zhang XQ, Pang ZJ, Chen SL, et al. p38MAPK inhibitor SB203580 in inhibition of in vitro invasion of human choriocarcinoma JAR cells[J]. Proc Oncol, 2003, 18(2):95-97.

[11] Stoneley M, Chappell SA, Jopling CL, et al. c-Myc protein synthesis is initiated from the internal ribosome entry segment during apoptosis[J]. Mol Cell Biol, 2000, 20(4):1162-1169.

[12] Bulavin DV, Saito S, Hollander MC, et al. Phosphorylation of human p53 by p38 kinase coordinates N-terminal phosphorylation and apoptosis in response to UV radiation[J]. EMBO J, 1999, 18(23):6845-6854.

[13] Kornmann M, Ishiwata T, Kleeff J, et al. Fas and Fas-ligand expression in human pancreatic Cancer[J]. Ann Surg, 2000, 231(3):368-379.

[14] Han J, Jiang Y, Li Z, et al. Activation of the transcription factor MEF2C by the MAP kinase p38 in inflammation[J]. Nature, 1997, 386(6622):296-299.

[15] Ghatan S, Larner S, Kinoshita Y, et al. p38 MAP kinase mediates bax translocation in nitric oxide-induced apoptosis in neurons[J]. J Cell Biol, 2000, 150(2):335-347.

[16] Nagata Y, Todokoro K. Requirement of activation of JNK and p38 for environmental stress-induced erythroid differentiation and apoptosis and of inhibition of ERK for apoptosis[J]. Blood, 1999, 94(3):853-863.

[17] New L, Jiang Y, Zhao M, et al. PRAK, a novel protein kinase regulated by the p38 MAP kinase[J]. EMBO J, 1998, 17(12):3372-3384.

[18] Dechert M, Holder JM. Gerthoffer WT. p21-activated kinase1 participates in tracheal smooth muscle cell migration by signaling to p38 MAPK[J]. Am J Physiol Cell Physiol, 2001, 281(1):C123.

[19] Bakin AV, Rinehart C, Tomlinson AK. et al. p38 mitogen-activated protein kinase is required for TGF-mediated fibroblastictrans differen-tiation and cell migration[J]. J Cell Sci, 2002, 115(15):3193.

[20] Singh S, Powell DW, Rane MJ, et al. Identification of the p16-Arc subunit of the Arp 2/3 complex as a substrate of MAPK-activated protein kinase 2 by proteomic analysis[J]. J Biol Chem, 2003, 278(38):36410-36417.