甲狀腺乳頭狀癌與基質金屬蛋白酶抑制因子3(TIMP3)基因啟動子甲基化的關系研究

阿布來提·麥麥提艾力， 哈德提·別克米托夫， 哈力木拉提·木爾提扎， 艾力·塞丁，西爾扎提·蘇來曼， 夏米西努爾·伊力克

(新疆醫(yī)科大學1基礎醫(yī)學院生物學教研室， 烏魯木齊 830011； 2第一附屬醫(yī)院病理科， 3第一附屬醫(yī)院血管甲狀腺外科， 烏魯木齊 830054；4新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院腫瘤外一科， 烏魯木齊 830000； 5新疆醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生物化學教研室， 烏魯木齊 830011)

甲狀腺癌是常見的內(nèi)分泌惡性腫瘤，在過去幾十年里其發(fā)病率在全世界范圍呈增長的趨勢，2010年男性和女性甲狀腺癌的發(fā)病率分別為4/100 000和12/100 000，成為第8個最常見的腫瘤，第5位女性常見腫瘤[1-3]。常見的甲狀腺癌有乳頭癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)、濾泡癌(follicular thyroid carcinoma,FTC)、髓樣癌(medullary thyroid carcinoma,MTC)等,其中乳頭癌(PTC)為最多,占甲狀腺惡性腫瘤的90%[4]。新疆人群甲狀腺癌發(fā)病率快速上升[5]。人體惡性腫瘤中甲狀腺癌的存活率相當高，其中乳頭狀癌的存活率最高，雖然甲狀腺癌發(fā)病率持續(xù)性增高，但隨著醫(yī)學檢驗技術的發(fā)展，甲狀腺癌的死亡率逐漸下降，生存率升高[6]。甲狀腺癌常以無痛性甲狀腺結節(jié)為主要臨床表現(xiàn)。臨床上主要通過觸診、甲狀腺彩色B超、同位素造影及細針穿刺細胞學檢查( fine needle aspirationbiopsy，F(xiàn)NAB) 等方法進行診斷，但這些方法均不能明確區(qū)分結節(jié)性甲狀腺腫良、惡性的情況[7]。因此探索新的早期診斷方法，以提高甲狀腺癌的診斷效率成為本領域的研究熱點,找出一種早期診斷的分子標志物是早期診斷以及提高惡性腫瘤患者存活率的一項重要措施。本課題組在前期研究中，通過蛋白表達分析發(fā)現(xiàn)基質金屬蛋白酶抑制因子3(TIMP3)等基因在甲狀腺癌中低表達，篩選出它們可能為甲狀腺癌特異性高甲基化候選基因[8]。本研究擬選TIMP3基因，利用亞硫酸氫鹽修飾(bisulfite sequencing，BSP)測序法和Sequenom Mass ARRAY 甲基化DNA定量分析平臺檢測該基因CpG島嶼在甲狀腺乳頭狀癌組織的甲基化狀態(tài)，研究其啟動子區(qū)CpG位點甲基化水平與甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生的內(nèi)在聯(lián)系。對比2種測序方法的結果，并評價TIMP3基因啟動子甲基化作為甲狀腺乳頭狀癌分子標志物的可能性和應用價值。

1 材料與方法

1.1臨床材料收集2011-2013年在新疆維吾爾自治區(qū)人民醫(yī)院和新疆醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院住院治療并確診的甲狀腺病變患者的新鮮手術切除組織標本46例，其中甲狀腺乳頭狀癌29例，結節(jié)性甲狀腺腫17例。

1.2儀器與試劑主要儀器：微型離心機(Eppendorf公司)，紫外分光光度計(Thermo公司)，PCR儀、Gel Doc XR凝膠成像儀(BIO-RAD公司)，Mass ARRAY Compact System、恒溫培養(yǎng)箱振蕩器(上海一恒公司)，電熱恒溫水槽(寧陽公司)。主要試劑：亞硫酸氫鹽修飾試劑盒(EpiTect Fast DNA Bisulfite KIT)，熱啟動DNA聚合酶(HotStartTaq DNA polymerase)，dNTP mix(QIAGEN生物公司), TA克隆試劑盒(TA Cloning kit),One shot top10化學感受態(tài)細胞(Invitrogen),質粒提取試劑盒(TIANGEN),IPTG, X-gal,氨芐青霉素(Amp， BioSharp生物公司)。

1.3方法

1.3.1 亞硫酸氫鹽修飾測序分析TIMP3基因啟動子甲基化水平

1.3.1.1 基因組DNA的制備及亞硫酸氫鹽修飾 取甲狀腺組織標本約50 mg ，在盛有液氮的研缽里研磨組織標本，并用微量移液器頭快速移入已標并記盛有600 μL組織裂解液 (TET)的1.5 mL EP管里。充分混勻，放于37℃水浴鍋65 min后，加入蛋白酶K 40 μL，顛倒混勻，56℃過夜。經(jīng)典酚氯仿法提取基因組DNA[9]，并質量檢測，采用 EpiTect Fast DNA Bisulfite Kit亞硫酸氫鹽修飾組織DNA。

1.3.1.2 BSP引物設計 登錄 GenBank，檢索TIMP3基因DNA序列，用Methyl primer express 軟件掃描上游DNA序列的CpG島，設計BSP引物。TIMP3基因上游引物序列：5′TTTTGGTTTGGGTTAGAGATATT 3′，下游引物序列：5′CCTCAAACCAATAACAAAACC 3′，產(chǎn)物長度：273 bp；該片段在啟動子區(qū)位點定位于-343～-71 bp。

1.3.1.3 PCR擴增 采用25 μL的PCR反應體系，其中含2.5 μL 10×PCR 緩沖液、2 μL 20 mM MgCl2、0.5 μL 10 mM dNTP、0.1 μL 熱啟動酶、上下引物各0.75 μL、5.0 μL DNA模板、13.4 μL無菌水。以水代替DNA為空白對照。設PCR儀程序為預變性95℃ 15 min,45 個循環(huán)(95℃ 40 s,52℃ 40 s，72℃ 1 min)，總延伸72℃ 10 min。用 2% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。

1.3.1.4 克隆測序 連接：在200 μL的 PCR管里建立10 μL鏈接反應體系，含有1 μL 5×Ligation buffer、2 μL PCR2.1載體(30 ng/μL)、1 μL新鮮PCR產(chǎn)物(約20 ng)、1 μL T4 DNA Ligase、5 μL DNA/RNAse free water等。將各組成成分加完后輕輕離心混勻，在PCR儀中14℃連接過夜。轉化：取連接反應液和One shot top10 化學感受態(tài)細胞，按照感受態(tài)細胞說明書上的操作步驟進行轉化，取150 μL轉化液涂布在含有100 μg/mL Amp、100 μL 20 mg/mL的X-gal和100 μL 25 mg/mL的IPTG溶液的LB固體平板上，將培養(yǎng)板在室溫放置60 min后倒置于37℃培養(yǎng)箱里，培養(yǎng)過夜13 h。準備 20 μL 的菌落PCR反應液、含有2.0 μL 10×PCR 緩沖液、1.0 μL 20 mM MgCl2、0.4 μL 10 mM dNTP、15 μL ddH2O、0.1 μL熱啟動DNA聚合酶及上下引物各0.75 μL，菌落為模板，以沒有轉化質粒的感受態(tài)細胞為模板的體系設為陽性對照，設PCR儀程序為15 min預變性，40個循環(huán)(95℃ 35 s,52℃ 35 s，72℃ 1 min),總延伸72℃ 10 min進行 PCR 擴增。用2%瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。37℃、170 r/min震蕩培養(yǎng)10 h含有目的片段的8 mL菌液，用TIANGEN質粒提取試劑盒提取質粒，送上海生物工程公司測序。

1.3.2 Sequenom Mass ARRAY甲基化定量分析TIMP3基因啟動子甲基化水平 以TIMP3基因啟動子區(qū)CpG島為目的片段，依托Sequenom MassARRAY 甲基化DNA定量分析平臺(北京博奧生物公司)，對甲狀腺病變組織DNA進行單一CpG位點甲基化定量檢測TIMP3基因啟動子區(qū) CpG位點甲基化水平。數(shù)據(jù)通過EpiTYPER軟件分析TIMP3基因甲基化程度，整理數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS19.0 軟件分析實驗數(shù)據(jù)，高甲基化克隆數(shù)百分比用χ2檢驗，獨立樣本比較采用t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1TIMP3基因啟動子甲基化水平的亞硫酸氫鹽測序法分析結果根據(jù)GenBank提供的TIMP3基因DNA序列，利用Methyl primer express 軟件設計BSP 引物。通過PCR 擴增、PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳分析，現(xiàn)擴增出的目的片段與預期大小一致(273 bp)(圖1)。亞硫酸氫鹽修飾測序結果顯示，TIMP3基因啟動子在甲狀腺乳頭狀癌組織中共有12個CpG位點出現(xiàn)甲基化，其中5個CPG位點(CpG-10、CpG-13、CpG-14、CpG-16、CpG-17)呈高度的甲狀腺乳頭狀癌特異性(圖2、表1)。TIMP3 基因在結節(jié)性甲狀腺腫的高甲基化克隆數(shù)為0，低甲基化克隆數(shù)為9，高甲基化克隆百分比為0%。而甲狀腺乳頭狀癌組織中的高甲基化克隆數(shù)為28，低甲基化克隆數(shù)為12，高甲基化克隆百分比為70%，顯著高于結節(jié)性甲狀腺腫的0%，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=14.7,P=0.000)。

M: Marker; 1～3: 甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺腫、空白對照組

圖1TIMP3基因PCR產(chǎn)物2%的瓊脂糖凝膠電泳圖

2.2TIMP3基因啟動子甲基化水平的SequenomMassARRAY定量分析結果分析Sequenom Mass ARRAY 提供的單一CpG位點甲基化定量數(shù)據(jù)顯示， TIMP3基因在甲狀腺乳頭狀癌組織的總體甲基化率均值(0.28)與結節(jié)性甲狀腺腫的總體甲基化率均值(0.15)差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TIMP3基因啟動子區(qū)3個位點(CpG-1、CpG-16、CpG-17)在甲狀腺乳頭狀癌組織中的甲基化率均值與結節(jié)性甲狀腺腫相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)(表2)。

注：Initial seq為原序列，中間有豎杠是說明相同堿基，無豎杠表示堿基不相同，Y表示該堿基為CpG位點，Y與C配對說明該位點是甲基化狀態(tài)。

圖2TIMP3基因在甲狀腺乳頭狀癌組織的BSP片段測序及序列對比結果

表1 TIMP3基因甲基化克隆單一CpG位點的甲基化百分比比較/個(%)

3 討論

DNA甲基化是指在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)的催化作用下，將甲基從SAM轉移并添加到胞嘧啶的第5位碳原子的過程[10]。腫瘤相關抑癌基因啟動子異常甲基化引起的基因沉默、轉錄表達缺失是惡性腫瘤早期診斷研究的熱點[11]。TIMP3是一種基質金屬蛋白酶組織抑制劑(tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)，是屬于TIMPs家族，與其他TIMPs不同，TIMP3是一種結合ECM的非可溶性蛋白。TIMP3抑制腫瘤的生長、侵襲和轉移血管生成，以防止由基質金屬蛋白酶促進間質基質的破壞(MMP)-3和阻斷VEGF結合的血管內(nèi)皮生長因子受體，因此甲基化介導的基因沉默的TIMP3基因可能在PTC侵襲和進展中發(fā)揮獨特的作用[12]。TIMP3的蛋白失活與腫瘤發(fā)生有關[13]，在胃癌和結腸癌中已被證實[14]，在甲狀腺乳頭癌中該基因啟動子高甲基化率為53%，這與甲狀腺侵染(38%)、淋巴結轉移(43%)和多灶性(49%)有關[15]。Hu等[16]發(fā)現(xiàn)TIMP3基因異常甲基化和基因沉默可能在乳頭狀甲狀腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起到重要作用。國外已有研究證明TIMP3在甲狀腺癌中呈低表達，在許多常見的腫瘤中出現(xiàn)該基因的缺失、5’端CpG的甲基化[17-18]。

表2 Sequenom MassARRAY定量分析 TIMP3基因啟動子在不同甲狀腺組的CpG位點甲基化狀況

甲基化分析方法眾多，其中亞硫酸氫鹽測序PCR法雖然技術復雜、費時、資金消耗大且快速大樣本檢測難度大，但是其為能夠準確地檢測到單個甲基化位點的最可靠的一種方法。該法首先對DNA進行亞硫酸鹽修飾，再通過PCR擴增和測序，即可發(fā)現(xiàn)未發(fā)生甲基化的胞嘧啶會轉化成胸腺嘧啶，而存在甲基化的胞嘧啶仍表現(xiàn)為胞嘧啶[19]。BSP法能明確目的片段中每一個CpG位點的甲基化情況,并可對特定片段內(nèi)每個堿基的甲基化狀態(tài)進行分析，為甲基化分析中最為直接和徹底的方法之一[20-22]。MassARRY Epityper DNA甲基化定量分析技術，結合了堿基特異性酶切反應和MALDI-TOF質譜檢測原理, 性能高，能夠分析長達500 bp的多個CpG位點，靈敏度高，能夠檢測值為5%的甲基化水平[23]。亞硫酸氫鹽修飾測序結果顯示TIMP3基因在甲狀腺癌組織中的高甲基化克隆百分比為70%，顯著高于結節(jié)性甲狀腺腫的比例(P<0.05)。TIMP3基因啟動子在甲狀腺乳頭狀癌組織中共有12個CpG位點出現(xiàn)甲基化，其中5個CpG位點呈高度的甲狀腺乳頭狀癌特異性。Sequenom Mass ARRY提供的單一CpG位點甲基化定量數(shù)據(jù)顯示TIMP3基因在甲狀腺乳頭狀癌組織的總體甲基化率均值高于結節(jié)性甲狀腺腫的總體甲基化率均值，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。TIMP3基因啟動子3個CpG位點在甲狀腺乳頭狀癌組織中的甲基化率均值與結節(jié)性甲狀腺腫相比差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。據(jù)BSP測序結果和Sequenom Mass ARRAY甲基化定量分析結果，認為TIMP3基因CpG-16及CpG-17位點可能為甲狀腺乳頭狀癌的啟動子甲基化檢測的關鍵位點，有望成為甲狀腺癌早期診斷的分子標志物。

TIMP3基因啟動子甲基化可能是甲狀腺癌的分子機制之一。TIMP3基因的腫瘤特異性甲基化可能是在惡性進展的關鍵一步。TIMP3基因的甲基化后沉默失活可能阻礙細胞凋亡，促進乳頭狀甲狀腺癌的生長和血管生成、侵襲及轉移。因此，影響到乳頭狀甲狀腺癌惡性進展的各個階段。TIMP3基因啟動子區(qū)CpG-16及CpG-17位點可能為甲狀腺乳頭狀癌的啟動子甲基化檢測的關鍵位點，亦可作為甲狀腺癌早期診斷的一種輔助性診斷指標，可能對早期診斷、預后判斷及病情觀察有一定的臨床參考價值，是其表達缺失的關鍵因素，也是甲狀腺乳頭狀癌干預基因表達調(diào)控的重要表觀遺傳學分子機制。TIMP3基因啟動子區(qū)CpG-16及CpG-17位點作為甲狀腺癌早期診斷的分子標志物工作有待進一步研究。

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