維藥鐵力木的生藥學特征及其不同萃取部位抗血小板聚集作用研究

艾力克木·吐爾遜， 熱娜·卡斯木， 王金輝， 木太力普·吐遜

(1新疆醫(yī)科大學藥學院, 烏魯木齊 830011; 2烏魯木齊市中醫(yī)醫(yī)院, 烏魯木齊 830000)

鐵力木是藤黃科鐵力木屬植物鐵力木(mesuaferreaLinn.)的干燥花蕾，分布于中國云南、廣西、廣東至熱帶北緣、印度、緬甸、斯里蘭卡、印尼、泰國及馬來西亞等地，是維吾爾醫(yī)常用藥材，其維吾爾名為那爾米西克，常用于濕寒性或黏液質性疾病，如寒性心虛、抑郁癥、神經衰弱及濕性胃虛等[1]。鐵力木不僅被維吾爾醫(yī)藥記載，還被國內的傣族醫(yī)藥和國外的巴基斯坦、泰國等國家的傳統(tǒng)醫(yī)藥中記載。目前國內外對鐵力木的研究不多見，國內主要研究了鐵力木種子的化學成分和活性、鐵力木樹的引種和栽培等方面，國外一些學者從鐵力木中分離得到了幾種香豆素類化合物[2]。研究表明，鐵力木具有較強的抗癌和抗氧化活性[3-5]。但尚未見有關維藥鐵力木的生藥學研究及其抗血小板聚集作用的研究報道，因此本研究維藥鐵力木生藥學特征及其不同萃取部位的抗血小板聚集作用，旨在為其鑒別和應用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1儀器薄層色譜自動點樣儀(Linomat5瑞士 CAMAG公司)，BC-2300準全自動三分群血液細胞分析儀(深州邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)，490-4D血小板凝聚儀(CHRONO-LOG，USA)，TDL-5A離心機(上海菲恰爾分析儀器有限公司)，薄層色譜攝像儀(Reprostar3瑞士 CAMAG公司)，OLYMPOSBH-2顯微鏡及萊卡數(shù)碼顯微鏡，SARTORIUS AI104電子天平。

1.2材料藥材鐵力木由新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院藥房提供，經新疆維吾爾自治區(qū)維吾爾醫(yī)院制劑中心質檢部鑒定為藤黃科鐵力木屬植物鐵力木(mesuaferreaLinn.)的干燥花蕾(批號：201210418)，薄層用硅膠G板(青島海洋化工集團公司)，齊墩果酸標準品(中國食品藥品檢定研究院，批號：110709-201206)，凝血酶(CASRN9002-04-4，USA，批號：T4648)，實驗中所用試劑均為分析純。

1.3實驗動物SPF級新西蘭種兔，體質量為(1.8±0.5)kg，均為雄性，由新疆醫(yī)科大學實驗動物中心提供[生產許可證：SCXK(新)2011-0004]。

1.4性狀鑒別取性狀完整的藥材并進行觀察、照相及描述。

1.5顯微鑒別[6]取1 g藥材用研缽研成粉末，經80目篩，分別用水合氯醛和蒸餾水處理制成臨時裝片，于顯微鏡下觀察和視頻采集。

1.6理化鑒別取60 g藥材粉末分成3份，分別用100 mL 95%乙醇、100 mL石油醚和100 mL蒸餾水回流提取2 h，過濾，濃縮至20 mL，按照文獻[7-8 ],系統(tǒng)地配置和使用化學試劑，觀察反應結果，初步鑒別鐵力木可能含有的化學成分。

1.7薄層鑒別取7 mg齊墩果酸對照品加甲醇定容至10 mL，配成0.7 mg/mL的齊墩果酸對照溶液，取1 g藥材加甲醇20 mL回流提取30 min，濾液濃縮至2 mL,此液為供試品溶液。利用高效薄層色譜技術將供試品和對照品各2 μL點在5 cm×10 cm羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠G高效薄層板上，展開條件進行篩選，在選擇好的展開條件下進行展開，取出晾干，噴完顯色劑后在105℃的薄層加熱器上加熱數(shù)分鐘，顯色后在可見光和紫外燈(365 nm)下觀察斑點顏色和位置。

1.8測定抗血小板活性(1)供試品溶液的制備:稱取粉粹過的鐵力木藥材1 kg，加8倍的95%乙醇，在80℃水浴鍋回流提取3次，合并提取液濃縮至浸膏完全干燥?？偺崛∥锱c適量的水混懸，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液濃縮至浸膏備用。鐵力木正丁醇和水萃取物直接用生理鹽水溶解，配成適宜的濃度，石油醚和乙酸乙酯萃取物用乙醇助溶，乙醇濃度低于5%，生理鹽水作為空白。(2)測定方法:采用比濁法[9-10]進行抗血小板凝聚作用的測定。每次以1只新西蘭種兔作為供血動物，耳緣靜脈采血，枸櫞酸鈉1∶9(V∶V)抗凝，1 000 r/min離心10 min 得到上層液即富血小板血漿(platelet-rich-plasma, PRP)，余下部分以3 000 r/min離心15 min，得到貧血小板血漿(platelet-poor-plasma, PPP)，用PPP 調零和稀釋 PRP中的血小板數(shù)至200×109/L，PPP調零，以270 μL PRP加30 μL受試樣品，37℃條件下預熱5 min，加入凝血酶(凝血酶終濃度為10 U/mL)，測定由凝血酶誘導的血小板聚集率。血小板聚集率越高，則說明受試樣品抗血小板聚集能力越弱。在490-4D型血小板聚集儀上進行血小板聚集測定，觀察5 min視其最大聚集率，計算最大抑制率 (%)=(對照管血小板聚集率-樣品管血小板聚集率)/對照管血小板聚集率×100%。

2 結果

2.1藥材形狀本品略呈研棒狀，長1～2 cm，表面光滑，質地硬而脆。花冠圓球形，直徑0.3～0.5 cm，褐黃色?；ò?個，倒卵形，重覆瓦狀抱合，花瓣彼此分離，展開時呈“十”字形?；ò陜葹樾廴锶?，搓碎后可見眾多棕褐色細長的花絲，花藥以基著式著生在花絲上。氣香，味微苦。

2.2粉末結構本藥材粉末中花粉粒數(shù)量較多，其中有1～3個萌發(fā)孔的、無萌發(fā)孔的和刺狀散孔的花粉粒，三孔花粉粒數(shù)量最多,其萌發(fā)孔多位于赤道上，除了有些三孔花粉粒形狀接近三角形以外其他的均為圓形，花粉粒直徑27～38 μm。導管數(shù)量也較多，都是螺紋導管，導管螺旋直徑為9～15 μm。草酸鈣蔟晶較多，分布于藥材粉末的每一個部位，草酸鈣蔟晶有球形的、多角形星狀的和方形的，直徑為6～20 μm。腺毛特別少，腺頭為單個細胞，腺柄由多個細胞組成。非腺毛有單細胞非腺毛和多細胞非腺毛，其中多數(shù)為多細胞非腺毛，有的呈鐮刀狀，頂端尖銳或稍鈍。氣孔為平軸式氣孔，直徑為21～26 μm。薄壁細胞呈類方形或多邊形，排列整齊，見圖1。

1:花粉粒；2:導管；3:草酸鈣蔟晶；4:非腺毛；5:氣孔；6:薄壁細胞

2.3理化鑒別結果通過系統(tǒng)定性試驗結果得知, 維藥鐵力木可能含有甾體、油脂類、黃酮、醌類、酚類、強心苷、香豆素、有機酸、糖類及苷類成分，見表1。

表1 鐵力木提取物的定性試驗結果

2.4薄層鑒別通過一系列比較后選定固定相為高效硅膠G板，展開系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯-丙酮-冰醋酸(10∶1∶1∶0.2)，顯色劑為10%硫酸,在此條件下供試品和對照品Rf值為0.48，噴完顯色劑后在可見光下相同的位置出現(xiàn)了紫色的斑點，將噴完顯色劑的板子置紫外燈(365 nm)下觀察，同樣在相同的位置出現(xiàn)了黃色熒光斑點，見圖2。

A:齊墩果酸對照品; B:鐵力木供試品

2.5抗血小板聚集實驗結果鐵力木正丁醇萃取部位由凝血酶誘導的抗血小板聚集作用最強, 10 μg/mL表現(xiàn)出顯著的抑制作用(P<0.01)，其抑制能力與同濃度的其他組分比較也較為明顯(P<0.05)；水、乙酸乙酯、石油醚萃取部位也具有強的抗血小板聚集作用，其10 μg/mL抑制作用顯著(P<0.01)。血小板聚集率與各組分質量濃度之間存在著明顯地劑量依賴性，見表2。

表2 鐵力木不同萃取部位對血小板聚集的影響

注：與對照組比較，*P<0.05，**P<0.01。

3 討論

顯微鑒別、理化鑒別包括薄層鑒別為藥材真?zhèn)舞b別的重要依據(jù)，是《中國藥典》中藥質量評價的基本方法。本研究顯微鑒別、理化鑒別實驗表明，鐵力木(mesuaferreaLinn.)在其粉末結構和薄層色譜方面具有可作為鑒別依據(jù)的特征，其主要的粉末顯微特征為花粉粒、草酸鈣蔟晶及導管，其數(shù)量極多，其中花粉粒多為球形三孔花粉粒，其萌發(fā)孔多位于赤道上，花粉粒直徑為27～38 μm。草酸鈣蔟晶有球形的、多角形星狀的和方形的，直徑為6～20 μm。導管均為螺紋導管，導管螺旋直徑為9～15 μm。在其薄層鑒別實驗，展開系統(tǒng)為石油醚-乙酸乙酯-丙酮-冰醋酸(10∶1∶1∶0.2),顯色劑為10%硫酸，此條件下齊墩果酸對照品和鐵力木供試品在Rf值為0.48處出現(xiàn)了紫色斑點。以上特征可作為藥材真?zhèn)舞b別的重要參考依據(jù)。體外實驗表明鐵力木正丁醇萃取部位的抑制凝血酶誘導的血小板聚集活性最強?，F(xiàn)代研究認為血小板聚集率可影響血粘度，血粘度及血小板聚集率等指標的異常是引發(fā)冠心病、血栓等心血管疾病的重要因素之一。因此，本課題將針對鐵力木進行更進一步的跟蹤分離分析及藥理實驗研究，為開發(fā)抑制血小板聚集及相關疾病的新藥提供依據(jù)。

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