胰蛋白酶水解制備胰酪胨的工藝條件研究

齊奇，劉河濤，楊文君，王銀，余建強

(寧夏醫(yī)科大學(xué) a.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院；b.藥學(xué)院，銀川 750004)

0 引 言

牛乳中含有大量的蛋白質(zhì),其質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為牛乳的3.3%～3.5%。主要有酪蛋白、乳白蛋白、乳球蛋白、乳鐵蛋白和一些具有重要生理功能的酶類,其中酪蛋白占78.8%，酪蛋白經(jīng)酶促水解后可以產(chǎn)生相應(yīng)的產(chǎn)物——胰酪胨[1]。胰酪胨，又稱胰酪蛋白胨(Casein Tryptone)、胰酶消化酪蛋白胨(Pancreatic digest of casein)，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白胨，含有豐富的氮源、氨基酸等，是微生物培養(yǎng)基關(guān)鍵原材料之一，能用于任何需要酪蛋白的胰酶或胰蛋白酶水解產(chǎn)物的配方之中，用于細(xì)菌的培養(yǎng)、分離、增殖、鑒定，以及無菌試驗培養(yǎng)基、厭氧菌培養(yǎng)基等細(xì)菌生化特性試驗用培養(yǎng)基的配置。特別是由于富含色氨酸可用于吲哚試驗培養(yǎng)基和營養(yǎng)要求較高的生物培養(yǎng)基[2-3]。

本研究中采用當(dāng)?shù)厮a(chǎn)鮮牛奶經(jīng)過等電點沉淀、洗滌、脫脂和凍干后生產(chǎn)的酪蛋白作為反應(yīng)底物，經(jīng)過胰蛋白酶水解后得到胰酪胨。分別研究pH值、反應(yīng)時間、水解溫度和酶與底物的濃度比對胰蛋白酶水解效率的影響，通過L9(34)正交表排列優(yōu)化提取工藝參數(shù)，以期達(dá)到提高酪蛋白原料的利用率。同時亦獲得成本較低、水解度高、氨基酸及其他各項理化性質(zhì)達(dá)標(biāo)的胰酪胨產(chǎn)品。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮牛奶，胰蛋白酶，酪蛋白，胰酪胨標(biāo)準(zhǔn)品，BCA蛋白濃度測定試劑盒。

1.2 儀器與設(shè)備

TU1810型紫外可見分光光度儀，L-8800型氨基酸分析儀，PowerDry LL3000凍干機(jī)，AnkeTDL-S-A臺式離心機(jī)，DK-s24恒溫水浴箱，Z-2000原子吸收光譜儀。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白的制備

(1)酪蛋白制備工藝流程

新鮮牛奶→等電點沉淀蛋白→離心洗滌(15 min，3 000 r/min)→抽濾洗滌→乙醚、乙醇脫脂→凍干

(2)酪蛋白制備工藝的參數(shù)確定[4-7]。為確定等電點法制備胰酪胨的最佳工藝條件，以100 mL經(jīng)巴氏消毒后的鮮牛奶為原材料設(shè)計單因素試驗進(jìn)行制備。固定其他條件，分別考察提取溫度(40，45，50，55，60 ℃)，pH值(4.3，4.5，4.7，4.9，5.1)對提取效果的影響。

(3)酪蛋白純度采用雙縮脲法測定。

1.3.2 胰酪胨的制備

1.3.2.1 胰酪胨制備工藝流程[8-11]

酪蛋白→加水后加熱90℃保持30 min→調(diào)節(jié)pH，溫度后加入胰蛋白酶→保持pH值，溫度消化2 h→加入胰蛋白酶，保持pH值溫度酶解1 h→加入胰蛋白酶，保持pH值溫度酶解1 h→加入冰醋酸，同時加入活性炭，95℃以上攪拌15 min→過濾后干燥→胰酪胨

1.3.2.2 胰酪胨制備工藝要點[12-17]

為確定胰蛋白酶水解制備胰酪胨最佳工藝條件，根據(jù)胰蛋白酶水解工藝設(shè)計試驗因素和水平，以水解度和氨基氮為考察指標(biāo)，對水解溫度、水解pH值、水解時間以及酶濃度和底物濃度比(E/S)，進(jìn)行L9(34)正交實驗，結(jié)果如表1所示。

表1 正交實驗因素水平

1.3.3 理化性質(zhì)檢測方法[18-19]

為確定根據(jù)以上工藝條件制備出的胰酪胨完全符合市售胰酪胨產(chǎn)品理化指標(biāo)要求，分別對其各項理化性質(zhì)進(jìn)行了檢測。

(1)水解度(DH)的測定水解度采用pH-STAT法。

(2)氨基氮測定采用甲醛滴定法。

氨基氨質(zhì)量分?jǐn)?shù)＝滴定用標(biāo)準(zhǔn)堿毫升數(shù)×堿濃度×1.4／樣品質(zhì)量。

(3)總脂、水分、灰分和總氮的測定方法參照國家標(biāo) 準(zhǔn) GB/T5009.5-2003，GB/T5009.10-2003，GB/T5009.3-2003，GB/T5009.4-2003中進(jìn)行。

(4)氨基酸的測定方法采用國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T18246-2000進(jìn)行。

(5)胰酪胨所含蛋白質(zhì)濃度檢測采用BCA法測定。

(6)微量元素測定采用原子吸收法。

2 結(jié)果與分析

2.1 酪蛋白制備單因素試驗

2.1.1 pH值對酪蛋白制備結(jié)果的影響

將100 mL經(jīng)過巴氏消毒后的鮮牛奶預(yù)熱至45℃時， 分別加入pH值為4.3，4.5，4.7，4.9和5.1的濃度為0.2 mol/L的醋酸——醋酸鈉緩沖液中沉淀10 min，后經(jīng)過排除乳清、水洗滌、脫脂和烘干得出酪蛋白，并檢測酪蛋白產(chǎn)率和酪蛋白純度。

由圖1可以看出，在溫度和提取時間固定的情況下，當(dāng)pH值在4.7時，酪蛋白的產(chǎn)量最高，而不同pH值下提取的酪蛋白純度相差不大。

圖1 pH值對酪蛋白制備結(jié)果的影響

2.1.2 溫度對酪蛋白制備結(jié)果的影響

將100 mL經(jīng)過巴氏消毒后的鮮牛奶分別預(yù)熱至40，45，50，55 ℃和60 ℃時， 分別加入pH值為4.7濃度為0.2 mol/L的醋酸——醋酸鈉緩沖液中沉淀10 min，后經(jīng)過排除乳清、水洗滌、脫脂和烘干得出酪蛋白，并檢測酪蛋白產(chǎn)率和酪蛋白純度。

圖2 溫度對酪蛋白制備結(jié)果的影響

由圖2可以看出，在pH值和提取時間固定的情況下，當(dāng)溫度在40℃時，酪蛋白的產(chǎn)量最高，而不同pH值下提取的酪蛋白純度相差不大。

2.2 胰蛋白酶水解制備胰酪胨工藝正交實驗2.2.1 以水解度為指標(biāo)進(jìn)行正交實驗[20-21]

以水解度為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實驗，結(jié)果如表2所示。

表2 胰蛋白酶水解正交試驗設(shè)計與結(jié)果

由表2可得出，以水解度為指標(biāo)，胰蛋白酶水解酪蛋白最佳條件為A2B2C3D1，即pH值為8.0，溫度50℃，水解時間2.5h，E/S為0.24，此時水解度達(dá)44.4%。根據(jù)極差分析各因素的影響順序為pH值＞酶解溫度＞酶解時間＞E/S。

2.2.2 以氨基氮為指標(biāo)進(jìn)行正交實驗

以水解度為指標(biāo)，進(jìn)行L9(34)正交實驗，結(jié)果如表3所示。

表3 胰蛋白酶水解正交試驗設(shè)計與結(jié)果

以氨基氮為指標(biāo)，表示的是制備出的胰酪胨中所含的在微生物生長初期可以被快速利用的營養(yǎng)成分含量，培養(yǎng)基中氨基氮的含量直接決定了培養(yǎng)基中能被微生物吸收的氮源含量。由表3可以看出，處于A1B1C3D3，即pH值為8.0，溫度40 ℃，水解時間1.5 h，E/S為0.32，此時氨基氮質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，達(dá)到4.5%。根據(jù)極差分析得出各因素的影響順序為pH值＞酶解溫度＞E/S＞酶解時間。

2.2.3 驗證試驗結(jié)果

以水解度為指標(biāo)，得出制備胰酪胨的最佳條件為A2B2C3D1；以產(chǎn)物中氨基氮為指標(biāo)，得出的制備最佳條件為A1B1C3D3。分別對工藝組合A2B2C3D1和A1B1C3D3進(jìn)行三次平行試驗，確定胰蛋白酶水解酪蛋白的最佳條件。在工藝組合A2B2C3D1中，平均水解度為43.68%，氨基氮為4.47%；而在工藝組合A1B1C3D3中，平均水解度為41.79%，氨基氮為4.52%。因此確定胰蛋白酶水解酪蛋白制備胰酪胨的最佳工藝條件為A2B2C3D1，即pH值為 8.0，溫度50℃，水解時間2.5 h，E/S為0.24。

2.3 胰酪胨理化性質(zhì)檢測結(jié)果

參照國內(nèi)蛋白胨質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和國外OXOID有關(guān)蛋白胨質(zhì)量指標(biāo)，將根據(jù)工藝條件A2B2C3D1制備出的胰酪胨進(jìn)行理化指標(biāo)的分析檢測，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可以看出，經(jīng)過以上工藝流程制備出的胰酪胨與OXOID生產(chǎn)的標(biāo)準(zhǔn)品相比，各項理化指標(biāo)接近。實驗制備的胰酪胨經(jīng)過檢測，總氮量與酪蛋白純度有關(guān)，實驗測得數(shù)據(jù)和標(biāo)準(zhǔn)相近。因此在制備胰酪胨時，酪蛋白選擇很重要?？偭住⒖傊?、灰分的測定結(jié)果都小于標(biāo)準(zhǔn)品，其中總脂小于標(biāo)準(zhǔn)品是因為我們給樣品采用了脫脂的實驗操作，從而優(yōu)化了胰酪胨的理化性質(zhì)。

圖3 各項理化性質(zhì)與標(biāo)準(zhǔn)品比較結(jié)果

2.4 微量元素檢測結(jié)果

為了確定制備出的胰酪胨符合微生物實驗所需，實驗測定了實驗測定了胰酪胨的微量元素項目，并且提供國外OXOID標(biāo)準(zhǔn)品的詳細(xì)參數(shù)，將制備的胰酪胨與標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行比較，結(jié)果如表4所示。

表4 微量元素分析 μg/g

通過表4可以看出，實驗制備出的胰酪胨各項微量元素水平除Ca以外，都和標(biāo)準(zhǔn)品相差不大，尤其是重金屬元素的水平還略低于標(biāo)準(zhǔn)品。Ca質(zhì)量分?jǐn)?shù)偏高是因為本地區(qū)的水質(zhì)偏硬，所含Ca偏高。

2.4 氨基酸檢測結(jié)果

氨基酸是蛋白胨中的主要成分之一，也是細(xì)胞生長過程中的重要營養(yǎng)成分。對所制備的胰酪胨進(jìn)行氨基酸分析，結(jié)果如表5所示。由表5可以看出，該蛋白胨中的必需氨基酸種類齊全且質(zhì)量分?jǐn)?shù)高，因此自制胰酪胨產(chǎn)品具有較高的營養(yǎng)價值。

表5 氨基酸組分分析 %

3 討 論

胰酪胨作為培養(yǎng)基關(guān)鍵原材料之一，其制備工藝以及制備出產(chǎn)品的質(zhì)量直接影響微生物實驗的結(jié)果。目前國內(nèi)生產(chǎn)胰酪胨的廠家參差不齊，生產(chǎn)出的胰酪胨產(chǎn)品質(zhì)量也無具體檢測標(biāo)準(zhǔn)。培養(yǎng)基是醫(yī)學(xué)衛(wèi)生研究、醫(yī)藥工業(yè)生產(chǎn)、臨床細(xì)菌檢驗、流行病學(xué)調(diào)查和生物制品制造等的重要基礎(chǔ)。胰酪胨作為培養(yǎng)基關(guān)鍵原材料，其質(zhì)量好壞直接決定了微生物檢驗和生物產(chǎn)品的產(chǎn)量和質(zhì)量。目前國內(nèi)對胰酪胨制備工藝的研究較少，尤其是對制備出的胰酪胨無一套完整的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，各項理化性質(zhì)檢測手段也比較單一。

本研究中首先通過進(jìn)行單因素試驗確定了制備酪蛋白的最佳條件，即pH值為 4.7，溫度40℃時酪蛋白產(chǎn)量最高。再通過分別以水解度和氨基氮為指標(biāo)進(jìn)行的L9(34)正交試驗確定胰蛋白酶水解酪蛋白制備胰酪胨的最佳水解參數(shù)，即pH 8.0，溫度55℃，時間2.5h，E/S為0.24，此時水解度達(dá)44.4%。按照此工藝條件制備出的胰酪胨通過各種檢測方法，將其各項理化指標(biāo)與國外同類型產(chǎn)品比較，差異不大，滿足胰酪胨產(chǎn)品的規(guī)格要求，符合微生物實驗所需。進(jìn)行微量元素測定也證明實驗制備出的胰酪胨各項微量元素水平與標(biāo)準(zhǔn)品接近，尤其是對微生物培養(yǎng)有害的重金屬元素含量極低。對所制得的胰酪胨進(jìn)行氨基酸分析，其氨基酸組成豐富，微生物生長所需的谷氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸等氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，其他必需氨基酸種類齊全且豐富可為微生物的生長提供豐富的營養(yǎng)。本實驗所優(yōu)化出的胰酪胨制備工藝條件可為今后進(jìn)行大規(guī)模高質(zhì)量胰酪胨生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，有著良好的經(jīng)濟(jì)效益和較好的產(chǎn)業(yè)化前景。

[1]李曉輝.牛乳中酪蛋白的結(jié)構(gòu)特性及其應(yīng)用[J].食品工業(yè)，2002，(1)：29-31.

[2]石丹，王彩云，云戰(zhàn)友，等.風(fēng)味酶水解乳清蛋白生產(chǎn)蛋白胨的工藝條件[J].中國乳品工業(yè)，2011，39(10)：208-211.

[3]高海燕，石丹，王彩云，等.利用復(fù)合酶技術(shù)制備乳清蛋白胨的工藝研究[J].中國食品學(xué)報，2013，13(2)：97-100.

[4]韓珍瓊，方建華.實驗室制備牛奶酪蛋白的技術(shù)研究[J].畜牧與飼料科學(xué)，2010，31(8)： 83-85.

[5]侯永新.酸法生產(chǎn)干酪素主要工藝條件優(yōu)化的研究[J].食品工業(yè)科技，2005，(10)：138-140.

[6]程濤，孫艷波.雙縮脲法測定乳中酪蛋白含量[J].中國乳品工業(yè)，2000，28(3)：34-36.

[7]李宏梁，焦茜楠，黃峻榕等.酪蛋白沉淀檢測方法及其在牛乳經(jīng)濟(jì)摻假鑒定中的應(yīng)用[J].食品科技，2008(12)：262-267.

[8]SIND AYIKENGERA SéVERIN，XIA WEN-SHUI.Nutritional evaluation of caseins and whey proteins and their hydrolysates from protamex[J].ZheJiang Univ Science，2006，(7)：90-98.

[9]高長永，于鵬，張?zhí)m威等.酪蛋白水解方法及水解產(chǎn)物功能性的研究進(jìn)展[J].中國乳品工業(yè)，2011，39(10)：38-40.

[10]呂桂善，周文紅，姜瞻梅，等.酪蛋白水解進(jìn)程的研究[J].食品工業(yè)科技，2003，24(8)：24-27.

[11]I SODINI，A LUCAS，J P TISSIER，et al.Physicalproperties and microstructure of yoghurts supplemented with milk protein hydrolysates[J].International Dairy Journal，2005(15)：29-35.

[12]DE SPIEGELEER P，SERMON J，LIETAERT A，et al.Source of tryptone in growth medium affects oxidative stress resistance in Escherichia coli[J].Appl Microbiol，2004，97(1)：124-33.

[13]OH S，RHEEM S，SIM J，et al.Optimizing conditions for the growth of Lactobacillus casei YIT 9018 in tryptone-yeast extract-glucose medium by using response surface methodology[J].Appl Environ Microbiol.1995，61(11)：3809-14.

[14]TURKI S，KRAEIM IB，WEECKERS F，et al.Isolation of bioactive peptides from tryptone that modulate lipase production in Yarrowia lipolytica[J].Bioresour Technol，2009，100(10)：2724-31.

[15]楊震，王愛霞，姬元忠，等.鹽酸快速水解酪蛋白工藝研究[J].食品研究與開發(fā)，2011，32(7)：44-47.

[16]劉亮亮.羊胰酶提取工藝及水解酪蛋白動力學(xué)研究[D].蘭州：甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010.

[17]王宗義，賈昌喜，韓濤，等.配合飼料基質(zhì)中碘化酪蛋白水解條件的優(yōu)化[J].北京農(nóng)學(xué)院學(xué)報，2012，4(1)：16-18.

[18]趙新淮，馮志彪.蛋白質(zhì)水解物水解度的測定[J].食品科學(xué)，1994，15(11)：65-67.

[19]王菊叢，賴陳潔.2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)中大腸菌群計數(shù)方法的研究和探討[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2011，1(1)：116-117.

[20]王順民，鄭銳.正交試驗優(yōu)化酶法提取菜籽皮不溶性膳食纖維工藝[J].食品科學(xué)，2013，34(8)：100-103.

[21]鐘源，肖文軍,馬蕊，等.正交試驗優(yōu)化馬鈴薯龍葵素提取技術(shù)[J].食品科學(xué)，2013，34(10)：6-10.