響應(yīng)面法優(yōu)化添加植物乳桿菌的益生菌發(fā)酵乳生產(chǎn)工藝研究

劉繼超，藥璐，姜鐵民，姜阿赤，李建濤，陳歷俊

(北京三元食品股份有限公司，北京100076)

0 引 言

發(fā)酵乳是歷史悠久的傳統(tǒng)產(chǎn)品，近年來隨著消費(fèi)者對發(fā)酵乳的口味、香氣、健康和安全的不斷追求以及科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，促進(jìn)了傳統(tǒng)發(fā)酵乳及其制品的現(xiàn)代化[1]。而益生菌是一類對人體健康產(chǎn)生積極作用的微生物[2]，依靠其特有的療效，特別是在維持胃腸道健康方面，因此含益生菌食品越來越受到人們的關(guān)注[3]。植物乳桿菌作為益生菌的一種，能通過胃并定植于腸道發(fā)揮有益作用[4]，如免疫調(diào)節(jié)、降膽固醇等作用，此外還具有維持腸道內(nèi)菌群平衡等多種功能[5]。將植物乳桿菌接種于牛乳中，發(fā)酵制成富含植物乳桿菌的發(fā)酵乳，既能保持酸奶細(xì)膩滑潤的凝乳狀態(tài)，又可提高酸奶的保健功能。因此，生產(chǎn)含有植物乳桿菌的益生菌產(chǎn)品越來越成為研究、開發(fā)、生產(chǎn)的焦點(diǎn)。

本實(shí)驗(yàn)將響應(yīng)面法應(yīng)用到發(fā)酵乳生產(chǎn)工藝研究中，以發(fā)酵過程中及后熟24 h后的pH值、酸度變化結(jié)合后熟發(fā)酵乳的感官評定、活菌數(shù)、質(zhì)構(gòu)分析為綜合指標(biāo)，優(yōu)化植物乳桿菌益生菌發(fā)酵乳的生產(chǎn)工藝參數(shù)，得到最佳生產(chǎn)工藝條件，從而為實(shí)際生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜熱鏈球菌(Streptococcus thermophilus,St,St-BODY-3)，保加利亞乳桿菌(Lactobacillus bulgaricus,Lb,Lb340)，植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum,Lp,Lp23508)，脫脂乳粉，MRS培養(yǎng)基。

LRH-250型生化培養(yǎng)箱，PB-10型pH計，自動高壓蒸汽滅菌鍋，TA-XTPlus質(zhì)構(gòu)儀。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化方法

將脫脂乳粉復(fù)原成質(zhì)量濃度為120 g/L的脫脂乳，放置0.5 h，使蛋白質(zhì)充分復(fù)水后分裝于三角瓶中，110℃滅菌10 min，冷卻至室溫，然后分別接種保加利亞乳桿菌、嗜熱鏈球菌和植物乳桿菌，置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行凝乳培養(yǎng)，反復(fù)傳代至活菌數(shù)達(dá)到實(shí)驗(yàn)要求。

1.2.2 酸乳生產(chǎn)工藝流程

脫脂乳粉120 g/L復(fù)原→滅菌(110℃，10 min)→冷卻→接菌→分裝→發(fā)酵→冷藏后熟(4℃，24 h)→成品1.2.3 檢驗(yàn)方法

(1)感官評定方法。根據(jù)我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 19302-2010發(fā)酵乳感官評定要求，并結(jié)合質(zhì)構(gòu)儀測定數(shù)據(jù)對實(shí)驗(yàn)所得的產(chǎn)品進(jìn)行感官評定，評定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

表1 酸乳的感官評定標(biāo)準(zhǔn)

(2)pH測定方法。采用pH計進(jìn)行測定，設(shè)定測定時間為發(fā)酵結(jié)束時和后熟24 h后。

(3)酸度值測定方法。以我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.34-2010中對酸度的測定為標(biāo)準(zhǔn)，利用濃度為0.1 mol/L的NaOH溶液對發(fā)酵乳的酸度進(jìn)行滴定，設(shè)定測定時間為發(fā)酵結(jié)束時和后熟24 h后。

(4)菌落計數(shù)方法。以我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 4789.2-2010為標(biāo)準(zhǔn)，利用平板計數(shù)法對發(fā)酵乳中活菌數(shù)進(jìn)行測定，設(shè)定測定時間為發(fā)酵后熟24 h后。

(5)質(zhì)構(gòu)儀測試。測試模式為compression，測試前下降速度為1.0 mm/s，測試速度為1.0 mm/s，測試后速度為10.0 mm/s，測試距離為30 mm，采用A/BE探頭，直徑40 mm。

1.2.4 發(fā)酵乳工藝設(shè)計

(1)單因素實(shí)驗(yàn)。在單因素試驗(yàn)中，菌種配比比例依次采用1:1，1:2，1:3，1:4，2:1，3:1； 接種量依次采用2%，3%，4%，5%，6%，7%；發(fā)酵溫度依次采用33，35，37，39，41，43 ℃；發(fā)酵時間依次采用3，5，7，9，11，13 h；每個試驗(yàn)均做3次平行。

(2)Box-Behnken實(shí)驗(yàn)。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計原理，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，確定Box-Behnken設(shè)計的自變量，以菌種配比比例、接種量、發(fā)酵溫度與發(fā)酵時間為因素，感官評分為響應(yīng)值，運(yùn)用Design-Expert 7.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，因素水平如表2所示。

表2 Box-Benhnken中心組合試驗(yàn)因素水平編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

通過感官評定、pH測定、酸度值測定、菌落計數(shù)等方法對單因素試驗(yàn)菌種配比、接種量、發(fā)酵溫度以及發(fā)酵時間進(jìn)行了優(yōu)化分析，得到單因素試驗(yàn)的最佳結(jié)果為：菌種配比(嗜熱鏈球菌+保加利亞乳桿菌)：植物乳桿菌=1：2、接種量4%、發(fā)酵溫度39℃、發(fā)酵時間7 h。

2.2 添加植物乳桿菌實(shí)驗(yàn)

2.2.1 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)設(shè)計與結(jié)果

響應(yīng)面法通過對所要優(yōu)化結(jié)果的因素及交互作用進(jìn)行研究，從而快速有效地確定多因子系統(tǒng)的最適條件[7-9]。中心組合設(shè)計(Central Composite Design,CCD)是目前較為常用的響應(yīng)面分析方法[10-14]。該法可通過響應(yīng)面等高線圖直觀地描繪出每個因子及其交互作用對過程的影響程度，從而得出目標(biāo)值最大時的最優(yōu)條件。

表3 響應(yīng)面分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3中， 實(shí)驗(yàn)1～24為析因試驗(yàn)，25～29為中心實(shí)驗(yàn)。29個實(shí)驗(yàn)點(diǎn)分為析因點(diǎn)與零點(diǎn)，其中析因點(diǎn)為自變量取值在A，B，C，D所構(gòu)成的三維頂點(diǎn)，零點(diǎn)為區(qū)域的中心點(diǎn)，零點(diǎn)實(shí)驗(yàn)重復(fù)5次，用以估計試驗(yàn)誤差。

采用Design-Expert 7.0軟件對所得數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA分析，結(jié)果如表5所示。各因素經(jīng)過擬合得到的回歸方程為：

Y=87.26-0.021A+1.21B+1.51C-0.24D+0.087AB+0.050AC-0.35AD+0.23BC+0.075BD+0.26CD-1.38A2-2.05B2-1.85C2-0.75D2。

由表4可以看出，感官評分最高的一組為第25組為87.8分，此時發(fā)酵乳硬度、稠度、凝聚性、黏 度 ， 分 別 為 171.619g，4127.621g·s，94.493g，244.817 g·s；其中凝聚性與黏度在所有中心組合實(shí)驗(yàn)中均高于其他各組，硬度與稠度均適中，凝塊結(jié)實(shí)，狀態(tài)細(xì)膩均勻，發(fā)酵乳固有的滋氣味也較濃。第13組的感官評分最低為81.20分，此時發(fā)酵乳硬度、稠度、凝聚性、黏度，分別為138.764g，3566.770g·s，82.834g，249.367g·s；其凝乳不結(jié)實(shí)，而且有大量的乳清析出，可能是由于接種量與發(fā)酵溫度均較低，造成前期發(fā)酵速度緩慢。

表4 添加植物乳桿菌的益生菌發(fā)酵乳發(fā)酵后熟24 h的質(zhì)構(gòu)指標(biāo)

表5 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)方差分析

由表5可以看出，軟件分析的模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9777，校正決定系數(shù)R2adj=0.9553，表明該模型擬合程度較好，可根據(jù)此模型分析與預(yù)測添加植物乳桿菌的益生菌發(fā)酵乳的生產(chǎn)工藝參數(shù)。P＜0.0001＜0.01，表明該模型顯著，該模型的一次項(xiàng)B和C極顯著，A和D不顯著，二次項(xiàng)A，B，C，D極顯著，交叉項(xiàng)均不顯著。

由表6可以看出，各組后酸化能力不同，均比較弱。其中第15組與第19組的酸度值最大且為140°T，其余各組的酸度均適中，符合國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的酸度值≥80 °T。 第7組乳酸菌活菌數(shù)最高為1.465×1010mL-1，乳酸菌活菌數(shù)最低的為第4組為7.30×107mL-1，但仍高于國家標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的乳酸菌活菌數(shù)最低值1.00×106mL-1。

2.2.2 響應(yīng)面直觀分析

運(yùn)用Design-Expert 7.0軟件對二次回歸模型進(jìn)行規(guī)范分析，考察曲面圖與等值線圖，結(jié)果如圖1～圖6所示，固定一個因素為零水平，考察兩兩因素對添加植物乳桿菌的益生菌發(fā)酵乳感官評分的影響。

圖1～圖6直觀地反映了各因素交互作用對響應(yīng)值的影響，比較6組圖可知，菌種接種量(B)與發(fā)酵時間(D)、發(fā)酵溫度(C)與發(fā)酵時間(D)的交互作用較其他各組交互作用更為顯著。

表6 添加植物乳桿菌發(fā)酵后熟24 h后的各項(xiàng)指標(biāo)測定結(jié)果

2.2.3 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)

對回歸方程求一階偏導(dǎo)數(shù)可得到4個方程：

聯(lián)立方程組，解得A=0.0196，B=0.3179，C=0.4228，D=-0.0754，即添加植物乳桿菌的益生菌發(fā)酵乳的最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)為A=1:2.0196，B=4.3179%，C=39.8456℃，D=6.8492 h，由回歸方程可以確定此時酸乳的感官評分最高為87.78分。

由于實(shí)驗(yàn)操作的可行性，將添加植物乳桿菌的益生菌發(fā)酵乳的最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)修正為：菌種配比比例為混菌(St∶Lb=1∶1)：植物乳桿菌為1∶2.02，菌種接種量4.32%，發(fā)酵溫度39.8℃，發(fā)酵時間為6.8 h，在此條件下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，結(jié)果得出發(fā)酵乳的感官評分平均為87.5分。與理論預(yù)測值基本吻合，充分驗(yàn)證了所建模型的正確性，因此利用響應(yīng)面分析法得到的添加植物乳桿菌的益生菌發(fā)酵乳的最佳工藝真實(shí)可靠，具有實(shí)際意義。

圖1 Y=f(A,B)的響應(yīng)面圖

圖2 Y=f(A,C)的響應(yīng)面

圖3 Y=f(A,D)的響應(yīng)面

圖4 Y=f(B,C)的響應(yīng)面

圖5 Y=f(B,D)的響應(yīng)面

圖6 Y=f(C,D)的響應(yīng)面

3 討 論

近年來關(guān)于對富含益生菌的發(fā)酵乳已有了一些研究，最佳工藝參數(shù)因菌種不同而異。李霞等[15]應(yīng)用正交試驗(yàn)方法優(yōu)化出富含植物乳桿菌酸奶的最佳工藝條件為：菌種配比1∶1∶2，接種量5%，發(fā)酵溫度39 ℃，發(fā)酵時間7 h。本研究在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上通過響應(yīng)面法確定了添加植物乳桿菌的益生菌發(fā)酵乳的最佳生產(chǎn)工藝條件為：菌種配比比例為混菌(St∶Lb=1∶1)：植物乳桿菌為1∶2.02，菌種接種量4.32%，發(fā)酵溫度39.8℃，發(fā)酵時間為6.8 h，在此生產(chǎn)條件下生產(chǎn)的植物乳桿菌酸發(fā)酵乳組織狀態(tài)均勻細(xì)膩，酸度適中，口感醇厚柔和，氣味濃郁，感官評分達(dá)到87.5分，該實(shí)驗(yàn)方法所得到的最佳生產(chǎn)工藝參數(shù)真實(shí)可靠，對酸乳工業(yè)化的生產(chǎn)有一定的指導(dǎo)意義。

[1]高松柏.發(fā)酵乳的最新進(jìn)展[J].中國乳品工業(yè)，2004，32(8)：46-49.

[2]DIOP L,GUILLOU S,DURAND H.Probiotic food supplement reduces stress-induced gastrointestinal symptoms in volunteers a doubleblind,placebo-controlled,randomized trial[J].Nutrition Research,2008,28:1-5.

[3]藥璐，閔偉紅，姜鐵民，等.添加干酪乳桿菌的益生菌酸乳生產(chǎn)工藝條件的優(yōu)化[J].食品工業(yè)科技，2013，34(6)：251-256.

[4]VRIES MC De,EVAUGHAN E,et al.Lactobacillus plantarum-survival,functional and potential probiotic properties in the human intestinaltract[J].Int.Dairy J.,2006,16(9):1018-1028.

[5]王水泉，包艷，董喜梅，等.植物乳桿菌的生理功能及應(yīng)用[J].中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2010，12(4)：49-55.

[6]范利華，楊潔彬，周山濤，等.乳酸發(fā)酵番茄汁、胡蘿卜汁風(fēng)味物質(zhì)研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1993(2)：18-24.

[7]AMBAT P,AYYANN C.Optimizing medium constituents and fermentation conditions for citric acid production from palmyra jaggery using response surface method[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2001,(17):331-335.

[8]RANTNAM B V V,NARASIMHA R,et al.Optimization of fermentation conditions for the production of ethanol from sago starch using response surface methodology[J].World Journal of Microbiology and Biotechnology,2003,(19):523-526.

[9]TRUPKIN S,LEVIN L,et al.Optimization of aculture medium for ligninolytic enzyme production and synthetic dye decolorization using response surface methodology[J].Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2003,30(12):682-690.

[10]AITAF M，NAVEENA B J，et al.Single step fermentation of starch to L-lactic acid by Lactobacillus amylophilus GV6 in SSF using inexpensive nitrogen sources to replace peptone and yeast extract-Optimization by RSM[J].Process Biochemistry,2006,(41):465-472.

[11]FRANCIS F,SABU A,et al.Use of response surface methodology for optimizing process parameters for the production of alpha amylase by Aspergillus orzae[J].Biochem Eng,2003,(15):107-115.

[12]NAVEENS B J,ALTAF M,et al.Direct fermentation of starch to L-lactic acid in SSF by Lactobacillus amylophilus GV6 using wheat bran as support and substrate-medium optimization using RSM[J].Process Biochem,2005,(40)：681-690.

[13]KOTZAMANIDIS C,RUKAS T,et al.Optimization of lactic acid production from beet molasses by Lactobacillus delbrueckii NCIMB 8130[J].World J Microbiol,2002,(18):441-448.

[14]BUSTOS G,MOLDES A B,et al.Optimization of D-lactic acid production by Lactobacilluscoryniformisusing responsesurface methodology[J].Food Microbiol,2004,(21):143-148.

[15]李霞，于長青.植物乳桿菌酸奶的加工工藝參數(shù)優(yōu)化研究[J].農(nóng)產(chǎn)品加工，2010，12：29-31+38.