嬰幼兒配方奶粉中鄰苯二甲酸酯的固相萃取凈化-氣相色譜-質(zhì)譜法測定

苗宏健，魯杰，梁麗娜，趙云峰

(1.國家食品安全風(fēng)險評估中心 衛(wèi)生部食品安全風(fēng)險評估重點(diǎn)實(shí)驗室，北京 100021；2.賽默飛世爾科技(中國)有限公司，北京 100044)

0 引 言

鄰苯二甲酸酯(PAEs)可通過遷移、揮發(fā)等途徑對食品造成污染[1]，部分PAEs具有內(nèi)分泌干擾作用[2-3]。為降低PAEs對健康的影響，歐盟指令No 10/2011及我國GB9685規(guī)定含PAEs材料不得接觸嬰幼兒配方食品[4-5]。

嬰幼兒配方奶粉基質(zhì)復(fù)雜，良好的樣品前處理和質(zhì)量保證是確保檢測結(jié)果可靠性的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，針對嬰幼兒配方奶粉的前處理方法主要以液液萃取法(LLE)[6-7]、固相萃取法(SPE)[8-9]和凝膠滲透色譜法(GPC)為主[10]。SPE較其他方法試劑使用量小，可有效降低試驗空白，但方法特異性、推廣性和實(shí)用性需進(jìn)一步論證。本文采用前期建立的PAEs測定同位素稀釋氣相色譜-質(zhì)譜法[10]，通過不同前處理方法的比較和優(yōu)化，選擇PSA/Slica的SPE凈化方式，建立了適合于嬰幼兒配方奶粉中PAEs的快速測定方法。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

布魯克450氣相色譜儀-320質(zhì)譜儀，PSA/Silica固相萃取柱 (1 000 mg/6 mL， 玻璃材質(zhì))，Extrelut NT(Merck KGaA， 德 國 )、AccuPrep MPSTM及 AccuVap FLXTM(J2 Scientific，美國)，乙腈(Fisher，HPLC 級，美國)，二氯甲烷(DikmaPure，農(nóng)殘級)，正己烷(TEDIA，Spectro級)。

鄰苯二甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液(CDN Isotopes INC.，1 000 μg/mL，溶劑為正己烷)：鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)、鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)、鄰苯二甲酸二異丁酯(DIBP)、鄰苯二甲酸二丁酯(DBP)、鄰苯二甲酸(2-甲氧基)乙酯(DMEP)、鄰苯二甲酸二(4-甲基-2-戊基)酯(BMPP)、鄰苯二甲酸二(2-乙氧基)乙酯(DEEP)、鄰苯二甲酸二戊酯(DPP)、鄰苯二甲酸二己酯(DHXP)、鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)、鄰苯二甲酸二(2-丁氧基)乙酯(DBEP)、鄰苯二甲酸二環(huán)己酯(DCHP)、鄰苯二甲酸二(2-乙基)己酯(DEHP)、鄰苯二甲酸二苯酯 (DphP)、鄰苯二甲酸二正辛酯(DNOP)、鄰苯二甲酸二壬酯(DNP)； D4-鄰苯二甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品(CDN Isotopes INC.，與上述標(biāo)準(zhǔn)溶液中16種標(biāo)準(zhǔn)品一一對應(yīng)，純度大于99.7%)

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制

將16種鄰苯二甲酸酯標(biāo)準(zhǔn)品溶液以正己烷稀釋至質(zhì)量濃度為10 μg/mL中間液，將16種D4-鄰苯二甲酸酯分別以稱重法配制成質(zhì)量濃度為10 μg/mL乙腈和正己烷標(biāo)準(zhǔn)中間液。準(zhǔn)確移取鄰苯二甲酸酯及D4-鄰苯二甲酸酯的中間液，配制成系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，D4-鄰苯二甲酸酯質(zhì)量濃度為0.1 μg/mL，鄰苯二甲酸酯的標(biāo)準(zhǔn)曲線工作范圍為0.02～2.0 μg/mL。

1.2.2 樣品提取

稱取0.5 g(精確至0.01 g)樣品于10 mL具塞玻璃刻度管，加入乙腈內(nèi)標(biāo)工作液40 μL，移取2 mL去離子水與樣品混溶。提取前加入1.0 g NaCl，以2 mL乙腈渦旋提取2 min，3次提取，3 000 r/min以上離心5 min，取2 mL上清液待凈化。

1.2.3 樣品凈化

將PSA/Silica固相萃取柱以5 mL二氯甲烷和5 mL乙腈活化后，以2 mL提取液上樣，以2 mL乙腈洗脫樣品，將4 mL乙腈接收。氮?dú)獯抵两珊?，? mL正己烷復(fù)溶，3 000 rpm以上離心5 min，上清液進(jìn)氣相色譜-質(zhì)譜儀檢測。

1.2.4 色譜及質(zhì)譜條件

氣相色譜參考條件：DB-5ms UI石英毛細(xì)管柱，柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm ，膜厚0.25 μm；高純氦氣，純度≥99.999%，恒流模式，流速1.0 mL/min；進(jìn)樣口溫度260℃；升溫程序為初溫60℃，保持1 min，以20℃/min升至220℃，保持1 min，再以5℃/min升至280℃，保持10 min；以20℃/min升至300℃，保持4 min。進(jìn)樣方式，柱上不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣量1 μL；傳輸線溫度280℃。

質(zhì)譜參考條件：電子轟擊源(EI)；電離能量70 eV；離子源溫度250℃；溶劑延遲6 min。

1.2.5 定性及定量離子

定性及定量離子參見文獻(xiàn)[10]。

2 結(jié)果與討論

2.1 條件優(yōu)化

2.1.1 樣品提取液的選擇

嬰幼兒配方奶粉基質(zhì)復(fù)雜，含有大量脂肪、蛋白質(zhì)、脂溶性維生素等干擾PAEs準(zhǔn)確定量的物質(zhì)。因此，對樣品進(jìn)行有效的提取，是定量分析PAEs的重要環(huán)節(jié)。提取溶劑的選擇主要包括兩種：Lambert[6]以正己烷與甲基叔丁基醚作為萃取溶液對樣品進(jìn)行提取，以乙腈反提正己烷。楊國良等[7]直接以乙腈對樣品進(jìn)行提取。本文對兩種提取方式進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)：以Lambert[6]方法提取，提取液大部分與樣品結(jié)合成膠狀，有乳化現(xiàn)象。同時以乙腈反提后，除DNOP、DNP外，其余PAEs基本無法從正己烷中提出，損失較大，且樣品有基質(zhì)效應(yīng)干擾，需串接質(zhì)譜檢測排除干擾；直接以乙腈提取，由于樣品中包裹DNOP和DNP等物質(zhì)，其絕對回收率均在50%以下。近期，Mir等[11]研究分散液液微萃取牛奶中PAEs時發(fā)現(xiàn)，乙腈可促進(jìn)牛奶中蛋白質(zhì)沉降，破除乳化現(xiàn)象；且在鹽的作用下，相比甲醇、丙酮和四氫呋喃等類似溶劑，乙腈與水的分層度最佳，利于提取。因此，本文在結(jié)合相關(guān)研究的基礎(chǔ)上，最終確定了以去離子水溶解樣品后，乙腈提取，NaCl破除乳化的樣品提取方案。

2.1.2 凈化手段的選擇

本文以LLE、SPE及GPC方法進(jìn)行樣品前處理比較。樣品取樣量及D4-PAEs檢測濃度一致。GPC方法參數(shù)參見文獻(xiàn)[10]，其他如表1所示。由圖1可以看出，直接以液液萃取法提取樣品帶有雜質(zhì)，影響DNOP和DNP定量分析。以弗羅里硅藻土凈化提取液，分析物和雜質(zhì)在柱上不保留，凈化效果差，無法減除雜質(zhì)對定量的影響。以GPC進(jìn)行凈化時，分子量較大的DNOP和DNP等的絕對回收率較低，且所用溶劑量較大。以PSA/Silica凈化時，雜質(zhì)保留柱上，PAEs被洗脫，DNOP和DNP的定量干擾被排除。近期WANG[8]和LIU[9]等采用的Fe3O4@SiO2-G或C18-Fe3O4@mSiO2固相萃取體系凈化奶制品，方法新穎性強(qiáng)，但此類實(shí)驗操作較為復(fù)雜，且具有很強(qiáng)的特異性，其實(shí)用性和推廣性仍需論證。而本文采用的固相萃取柱為成熟產(chǎn)品，經(jīng)濟(jì)實(shí)用且推廣性較強(qiáng)。且本方法所用溶劑量小，操作簡單快捷，減除基質(zhì)干擾明顯，適用于快速高效準(zhǔn)確的檢測奶粉中PAEs。

表1 樣品提取及凈化方式

2.2 線性試驗和靈敏度

本方法采用在空白樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)溶液(10 μg/mL)的方法，按照IUPAC和美國化學(xué)聯(lián)合會中環(huán)境分析化學(xué)的規(guī)定平行測定20次得出[12]。16種PAEs的檢出限在15～30 μg/kg，定量限為50～100 μg/kg。 其中，DMEP、DEEP及DBEP的檢出限與定量限高于其余PAEs，這主要是因為DMEP、DEEP及DBEP碳鏈的化學(xué)結(jié)構(gòu)與其他PAEs不同，造成其定量離子m/z 149的前體離子裂解效率低，m/z 149分子離子峰面積響應(yīng)低導(dǎo)致。

圖1 嬰幼兒配方奶粉的前處理方式比較

2.3 準(zhǔn)確度和精密度

依照本方法的定量限，在含量低于方法檢出限的樣品中加入混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗，加標(biāo)濃度分別為各PAEs定量限的1倍、3倍和5倍，平行測試6次。由圖2看出，嬰幼兒配方奶粉的加標(biāo)回收率在74%～124%之間。計算平行測定的RSD，在0.78%～7.1%之間。

表2 方法的線性、檢出限和定量限 μg/kg

圖2 嬰幼兒配方奶粉的加標(biāo)回收率

2.4 實(shí)際樣品測定

為驗證方法適用性，本文對市售的37份嬰幼兒配方奶粉進(jìn)行檢測。結(jié)果如表3所示，樣品中主要檢出DMP、DEP、DBP和DEHP。其中，嬰幼兒配方奶粉中DBP最大值為165 μg/kg，含量約為衛(wèi)生部發(fā)布的551號文件《衛(wèi)生部辦公廳關(guān)于通報食品及食品添加劑中鄰苯二甲酸酯類物質(zhì)最大殘留量的函》中規(guī)定的DBP在食品中最大殘留量300 μg/kg的55%；而DEHP測試值均在定量限以下，最大值為文件規(guī)定最大殘留量的2.8%。

表3 樣品測試結(jié)果(n=3)

3 結(jié) 論

本文以乙腈作為提取劑，采用PSA/Silica柱固相萃取凈化，建立了嬰幼兒配方奶粉中PAEs測定的同位素稀釋氣相色譜-質(zhì)譜法。本方法簡便快捷，準(zhǔn)確可靠。

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