流式細胞術(shù)分析牛乳鐵蛋白素對Jurkat細胞增殖、分化的影響

王靜，趙寧，李萌，張艷杰，張書義，滕國新，宋真，劉寧,，許曉曦

(1.東北農(nóng)業(yè)大學 a.食品學院，b.乳品科學教育部重點實驗室，哈爾濱 150030；2.黑龍江省乳品工業(yè)技術(shù)開發(fā)中心，哈爾濱 150028；3.上海晨冠乳業(yè)有限公司，上海 201401；4.全國畜牧總站，北京 100125； 5.北京城市學院，北京100094)

0 引 言

牛乳鐵蛋白素(Bovine Lactoferrcin，LfcinB)是牛乳中的乳鐵蛋白在酸性環(huán)境條件下經(jīng)胃蛋白酶作用從N端釋放的一段多肽[1]，除了不能促進鐵的吸收外，完全具備乳鐵蛋白生物活性[2]，可用于保健食品、藥品中，作為營養(yǎng)強化劑并能提高人的免疫力，有抗癌的作用[3]，且在其發(fā)揮抗癌作用濃度范圍內(nèi)對人正常細胞活性沒有影響[1]。因此，LfcinB在抗腫瘤方面有相當大的潛力。

目前關(guān)于LfcinB抗腫瘤作用研究多集中于其誘導腫瘤細胞凋亡作用[4]，從增殖周期和分化抗原表達水平來探討LfcinB對腫瘤細胞的抑制增殖、誘導分化作用國內(nèi)還少有報道。本研究采用流式細胞術(shù)分析LfcinB對Jurkat細胞增殖、分化的影響，為進一步深入研究LfcinB抑制白血病細胞增殖、誘導細胞分化的分子機理及其在食品中的應用開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

Jurkat細胞，LfcinB，RNA酶，RPMI1640培養(yǎng)基，無支原體胎牛血清，二甲基亞砜(DMSO)，NBT，雷帕霉素，CCK-8試劑盒，碘化丙啶，F(xiàn)ITC標記的鼠抗人CD11b抗體。

1.2 細胞培養(yǎng)及處理

將細胞在含有10%熱滅活胎牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)，并置于37℃質(zhì)量分數(shù)為5%的CO2，相對飽和濕度的孵育箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細胞，加入一定濃度梯度的LfcinB處理細胞，LfcinB的質(zhì)量濃度梯度為50，100，200 mg/L和400 mg/L， 陽性對照組培養(yǎng)液中僅加100 nmol/mL的雷帕霉素(RAPA)，以未加LfcinB刺激的對數(shù)生長期Jurkat細胞為空白對照組。

1.3 CCK-8法檢測LfcinB對Jurkat細胞增殖的影響

取對數(shù)生長期的Jurkat細胞，調(diào)整細胞濃度接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔加入100 μL細胞懸液，加處理因素分別培養(yǎng)24 h、48 h和72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，37℃孵育1 h，于酶標免疫測定儀測定450 nm處的吸光值。每組設(shè)3個復孔，計算細胞增殖抑制率。

增殖抑制率=[(對照組-空白組)-(給藥組-空白組)]/(對照組-空白組)×100%。

1.4 流式細胞術(shù)檢測LfcinB對Jurkat細胞周期分布的影響

將Jurkat細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，加處理因素處理細胞48 h，離心去上清液，PBS洗滌一次，于70%乙醇中4℃固定細胞過夜，1 000 g離心5 min，PBS洗滌一次，加入適量的含RNase的碘化丙啶染色液，重懸細胞，37℃避光孵育30 min，進行流式細胞儀檢測，并結(jié)合ModFit軟件推算出各細胞周期相細胞所占比例，并計算細胞增殖指數(shù)(PI)[5]。

式中：G1/G0為處于G1/G0期細胞所占比例；G2/M為處于G2/M期細胞所占比；S為處于S期細胞所占比例。

1.5 NBT還原反應檢測LfcinB對Jurkat細胞分化的影響

將濃度為1×106mL-1的Jurkat細胞懸液接種于12孔板中培養(yǎng)24 h，按100 μL/孔接種于96孔板中，設(shè)定3個復孔。每孔加入含NBT 1.25 g/L及BSA 17 g/L的PBS混合液100 μL，37℃孵育2 h， 離心去上清， 加入DMSO 150 μL/孔，震蕩10 min，酶標儀測定580 nm處OD值。

1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞分化抗原CD11b的表達

將細胞懸液1 mL接種于12孔板中培養(yǎng)24 h，離心棄上清液。用PBS液洗滌一次，500 μL PBS液重懸后加入FITC標記的鼠抗人CD11b抗體10 μL，4℃下避光孵育40 min，陰性對照僅加相應PBS孵育，PBS洗滌一次，加500 μL PBS，用流式細胞儀檢測CD11b陽性率。

1.8 統(tǒng)計學分析

實驗重復3次，每次設(shè)置3個平行樣。用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件對所獲得的實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，判斷實驗結(jié)果的統(tǒng)計學意義。各實驗組數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差(x±s)表示，單因素方差分析比較各實驗組差異顯著性，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 CCK-8法檢測LfcinB對Jurkat細胞的抑制作用

檢測LfcinB對Jurkat細胞增殖的影響，結(jié)果如圖1所示。由圖1可以看出，當作用時間相同時，隨著LfcinB濃度增加，Jurkat細胞的增殖抑制率亦隨之增加 (P＜0.01)。此外，隨著作用時間的延長，各濃度的Jurkat細胞增殖抑制率也逐漸升高(P＜0.01)。因此表明，LfcinB能顯著抑制Jurkat細胞增殖，并具有劑量和時間依賴性。

2.2 LfcinB對Jurkat細胞周期的影響

流式細胞儀檢測LfcinB對Jurkat細胞周期分布的影響，結(jié)果如圖2和圖3所示。由圖2和圖3可以看出，隨著LfcinB濃度增加，細胞在G1/G0期百分率明顯上升(P＜0.01)，而S期的細胞百分率則顯著下降(P＜0.01)，增殖指數(shù)也顯著下降(P＜0.01)(見圖4)，具有劑量依賴性。由此可見，LfcinB可抑制Jurkat細胞增殖并能將其細胞周期阻滯于G1/G0期。

2.3 NBT還原反應檢測Lfcin B對Jurkat細胞分化的影響

將Jurkat細胞經(jīng)不同濃度LfcinB處理，然后檢測其NBT還原反應的OD值，結(jié)果如圖5所示。由圖5可以看出，當作用時間相同時，隨著LfcinB質(zhì)量濃度增加，OD值也隨之上升(P＜0.01)。此外，隨著作用時間的延長，各質(zhì)量濃度的OD值也隨時間的延長而提高(P＜0.01)。該OD值反應細胞的NBT還原能力，亦間接反應細胞的分化程度，因此以上結(jié)果說明LfcinB能誘導Jurkat細胞分化，并具有劑量和時間依賴性。

2.4 LfcinB對Jurkat細胞分化抗原CD11b表達的影響

利用流式細胞儀檢測藥物處理后細胞表面分化抗原CD11b表達水平變化，結(jié)果如圖6和圖7所示。由圖6和圖7可以看出，隨著LfcinB質(zhì)量濃度增加，Jurkat細胞表面分化抗原CD11b陽性率明顯提高 (P＜0.01)，具有劑量依賴性，表明LfcinB誘導Jurkat細胞分化的能力隨著濃度提高而增強。

圖3 不同質(zhì)量濃度LfcinB對Jurkat作用48 h后不同時期細胞百分率

圖4 不同質(zhì)量濃度LfcinB對Jurkat細胞增殖指數(shù)的影響

圖5 不同質(zhì)量濃度LfcinB對Jurkat細胞分化的影響

圖6 不同質(zhì)量濃度LfcinB對Jurkat細胞表面分化抗原表達的影響

圖7 不同質(zhì)量濃度LfcinB對Jurkat細胞表面分化抗原CD11b陽性率的影響

3 結(jié)果與討論

白血病是造血系統(tǒng)的惡性疾病，俗稱“血癌”，是國內(nèi)十大高發(fā)惡性腫瘤之一，嚴重威脅著人們的健康。惡性增殖是癌細胞一大特點，通過抑制癌細胞無限增殖可起到潛在的預防、治療癌癥的作用。研究發(fā)現(xiàn)，口服乳鐵蛋白和乳鐵蛋白素能提高幼年和成年動物的抗癌、抗炎和抗微生物感染能力[6,7]，而使用乳鐵蛋白作用人的乳腺癌細胞可導致癌細胞生長受到抑制[8]，此外人宮頸內(nèi)膜的致瘤性轉(zhuǎn)化與乳鐵蛋白表達下調(diào)有關(guān)，并伴隨著明顯的細胞增殖[9]。本研究選用Jurkat T細胞為細胞模型，研究LfcinB對其增殖的影響，發(fā)現(xiàn)LfcinB能夠明顯抑制Jurkat細胞增殖，這與上述結(jié)果一致。

細胞周期是指細胞一次有絲分裂完成開始到下一次有絲分裂結(jié)束所經(jīng)歷的全過程,包括G1、S、G2和M期。細胞周期失控是細胞異常增殖的重要原因之一，通過阻斷細胞周期進程，可導致有絲分裂異常或停滯，使癌細胞無法繼續(xù)分裂，進而抑制癌細胞的生長。以往研究表明，乳鐵蛋白可以通過周期阻滯抑制鼻咽癌、乳腺癌等腫瘤細胞增殖[8,10]。王雷等也研究發(fā)現(xiàn)重組人乳鐵蛋白可以阻斷口腔癌細胞周期進程，誘導G1/G0期阻滯[11]。本研究使用流式細胞儀觀察不同濃度LfcinB處理Jurkat細胞后細胞周期分布變化，發(fā)現(xiàn)處于G1/G0期的Jurkat細胞蓄積增多，處于S期細胞明顯減少，說明DNA合成受阻,細胞不能進入分裂期，腫瘤細胞轉(zhuǎn)向非增殖細胞群。這與Wolf等研究發(fā)現(xiàn)乳鐵蛋白通過G1/G0期阻滯來抑制腫瘤細胞增殖的結(jié)果一致[12]。表明LfcinB可能通過阻滯Jurkat細胞于G1/G0期發(fā)揮其增殖抑制效應。

與細胞惡性增殖、凋亡受阻一樣，細胞分化異常在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義,白血病的發(fā)生就是多能造血干細胞在發(fā)育分化的某一階段分化受阻的結(jié)果[13]。如何逆轉(zhuǎn)惡性腫瘤細胞的異常分化是腫瘤研究的重要領(lǐng)域。在細胞分化過程中，細胞表面分化抗原也會相應發(fā)生改變，CD11b為Jurkat細胞表面分化抗原，應用單克隆抗體測定細胞表面分化抗原的表達可較精確地判斷Jurkat細胞是否發(fā)生分化。在許多組織中，細胞由增殖到分化的轉(zhuǎn)化是一個細胞周期阻滯與細胞分化激活相互協(xié)調(diào)的過程，人們通常認為G1/S期阻滯可能是增殖/分化相互轉(zhuǎn)化的樞紐[14]。本研究中，NBT還原性隨著濃度增加而增強，而NBT的還原性也直接反應了細胞分化程度，此外CD11b陽性率隨著質(zhì)量濃度提高增加，表明LfcinB能誘導Jurkat細胞分化，這與肖暉等研究認為乳鐵蛋白呈時間和濃度依賴性促進大鼠成骨細胞分化的結(jié)果一致[15]。

本研究初步闡明了LfcinB對Jurkat細胞增殖、分化的影響，這為LfcinB抗白血病的研究提供了實驗支撐，為乳鐵蛋白素保健品的開發(fā)應用奠定了理論基礎(chǔ)，但其分子機制還有待進一步研究。

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