山羊乳酪蛋白酶解條件優(yōu)化及其抗菌活性研究

蘇晉文，李志成，任嬌，郝潔，付芒娟

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 楊凌712100)

0 引 言

抗菌肽是存在于生物體內(nèi)能抵抗外界微生物侵害，消除體內(nèi)突變細(xì)胞的一類由基因編碼或經(jīng)大分子蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的小分子多肽[1]，具有廣譜抗細(xì)菌、真菌、病毒、和寄生蟲(chóng)的活性，且不易產(chǎn)生耐藥性[2-3]，是一類具有巨大發(fā)展?jié)摿Φ男滦涂咕镔|(zhì)。

乳酪蛋白在酶解過(guò)程中可以產(chǎn)生多種生物活性肽[4-5]，在牛乳酪蛋白酶解物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種抗菌肽[6-8]。山羊乳是北方僅次于牛乳的第二大乳源，山羊乳酪蛋白和牛乳酪蛋白在蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)、氨基酸序列等方面存在較大差異[9-11]，以山羊乳酪蛋白為原料同樣能獲得多種活性肽[12-13]。目前對(duì)山羊乳酪蛋白抗菌肽的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以山羊乳酪蛋白為原料，探索山羊乳酪蛋白抗菌肽的最適酶解條件，為山羊乳的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

無(wú)抗山羊乳，購(gòu)于西北農(nóng)林科技大學(xué)畜牧場(chǎng)；沙門(mén)氏菌(Salmonella LT2)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus 26111)、大腸桿菌(Escherichia coli ACTT25922)，西北農(nóng)林科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院保存。

考馬斯亮藍(lán)G-250，胰蛋白酶(80 000 U/g)，堿性蛋白酶(8 000 U/g)，木瓜蛋白酶(40 000 U/g)，中性蛋白酶(40 000 U/g)，胃蛋白酶(3 000～3 500 U/g)；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

UV-1700雙光束紫外光分光光度計(jì)，PK121R型低溫冷凍離心機(jī)，水浴鍋，SB5200DT超聲清洗機(jī)，ES315高壓蒸汽滅菌鍋，PYX-DHS-40×50-BS-П隔水式恒溫培養(yǎng)箱(HES-380)；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)。

1.3 乳酪蛋白制備

新鮮無(wú)抗山羊乳4℃條件下，5 000 r/min離心20 min脫脂，離心后的溶液用濃度為2 mol/L的HCl溶液調(diào)節(jié)pH值至4.3，在40℃水浴鍋中靜置30 min沉淀酪蛋白，沉淀完全后5 000 r/min離心10 min，棄去上清液，用濃度為50 mmol/L(pH=4.4)HAc-NaAc緩沖液洗滌所得沉淀2～3次，洗滌后5 000 r/min離心10 min，即得酪蛋白粗品。

1.4 酪蛋白酶解液制備

稱取適量酪蛋白于三角瓶，加濃度為0.1 mol/L的NaOH助溶，定容，沸水浴加熱10 min，殺菌。冷卻后，放入60℃的恒溫水浴鍋中，等到酶解液溫度與水浴鍋溫度一致，調(diào)節(jié)溶液pH值至最適，并準(zhǔn)確加入蛋白酶。水解過(guò)程不斷滴加濃度為1 mol/L的NaOH，維持反應(yīng)體系pH值恒定，到達(dá)規(guī)定酶解時(shí)間后，沸水浴加熱滅酶10 min，冷卻離心，取上清液備用[14]。

1.5 蛋白酶的篩選

[15]和[16]中的方法，分別采用中性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、堿性蛋白酶和胃蛋白酶在表1所示的條件下酶解山羊乳酪蛋白，根據(jù)酶解液對(duì)金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌和大腸桿菌抑菌圈直徑大小篩選出抑菌效果最好的蛋白酶。

表1 5種蛋白酶的酶解條件

1.6 酶解條件優(yōu)化

1.6.1 單因素實(shí)驗(yàn)

(1)時(shí)間的確定。在酶解溫度為60℃，pH值為5.5，加酶量為 4 500 U/g，底物濃度為60 g/L的反應(yīng)體系下，以時(shí)間為0.5 h和1.5～5.5 h做單因素實(shí)驗(yàn)，以酶解液抑菌圈直徑大小為指標(biāo)，確定適宜酶解時(shí)間。

(2)加酶量的確定。選用適宜酶解時(shí)間，在酶解溫度為60℃，pH值為5.5，底物質(zhì)量濃度為60 g/L的反應(yīng)體系下，按 2 000 U/g和3 000～7 000 U/g加入木瓜蛋白酶，以酶解液抑菌圈直徑大小為指標(biāo)，確定適宜酶用量。

(3)底物質(zhì)量濃度的確定。選用適宜酶用量和酶解時(shí)間，分別在底物質(zhì)量濃度為4，6，8，10，12 g/L的條件下酶解酪蛋白，以酶解液抑菌圈直徑大小為指標(biāo)，確定適宜底物質(zhì)量濃度。

(4)pH值的確定。選用適宜酶用量、酶解時(shí)間和底物質(zhì)量濃度，分別在pH值為3，4，5，6，7和8條件下進(jìn)行酶解，以酶解液抑菌圈直徑大小為指標(biāo)，確定適宜酶解pH值。

1.6.2 正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到的最適條件，以底物濃度、加酶量、pH值、酶解時(shí)間為實(shí)驗(yàn)因素，按照L9(34)進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，以酶解液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的抑菌圈直徑為指標(biāo)，確定木瓜蛋白酶酶解羊乳酪蛋白的最佳工藝條件。

1.7 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.7.1 酪蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定

采用微量凱氏定氮法[17]測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。測(cè)得山羊乳酪蛋白蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為18.78%。

1.7.2 抑菌活性測(cè)定

本研究指示菌為大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌。

(1)培養(yǎng)基制作。稱取牛肉膏5.00 g，胰蛋白胨10.00 g，NaCl為5.00 g， 瓊脂10～12 g， 蒸餾水加熱溶化，冷卻，定容至1 000 mL，調(diào)節(jié)pH值為7.2～7.4。

(2)菌種活化。無(wú)菌操作條件下用接種環(huán)將斜面保藏的菌種接種于滅好菌的營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面上，37℃培養(yǎng)24 h，連續(xù)接種兩代，于4℃冰箱中備用。

(3)菌懸液的制備及活菌計(jì)數(shù)。無(wú)菌條件下，用生理鹽水將活化的菌種從斜面洗下，震蕩均勻進(jìn)行逐級(jí)稀釋，取100 μL進(jìn)行平板涂布，37℃倒置培養(yǎng)培養(yǎng)16～24 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，計(jì)算原液濃度。

(4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制。 將原液按2，3，4，6，8，9，10，50，100的倍數(shù)稀釋，在560 nm處測(cè)定各稀釋液OD值，以不同稀釋度的菌落數(shù)為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)曲線吸光度，調(diào)整菌液濃度最終為107mL-1，3種菌吸光值與菌液濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

(5)抑菌活性測(cè)定

參考文獻(xiàn)[18]和[19]中的方法，測(cè)定試樣對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和沙門(mén)氏菌的抑菌圈直徑。具體方法為：在無(wú)菌條件下，取107mL-1的菌液100 μL均勻涂布于營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上，在超凈工作臺(tái)中靜置20 min，待菌液吸收后用無(wú)菌的外徑為8 mm的小鋼管在瓊脂平板上挖洞，每孔加入90 μL樣品溶液，水平置于4℃冰箱中約2 h讓樣品溶液完全擴(kuò)散，再移至37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15～24 h，觀察結(jié)果，有抑菌圈出現(xiàn)的樣品，以游標(biāo)卡尺量其取抑菌圈的直徑。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS19.0軟件進(jìn)行結(jié)果統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(±s)的形式表示，每組試驗(yàn)進(jìn)行3～6個(gè)重復(fù)，必要時(shí)進(jìn)行方差顯著性比較。

2 結(jié)果分析

2.1 山羊乳酪蛋白水解酶的篩選

5種蛋白酶酶解山羊乳酪蛋白酶解液對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的最佳抑菌效果見(jiàn)表2。

由表2可以看出，陽(yáng)性對(duì)照青霉素對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌均有顯著抑制作用，堿性蛋白酶酶解物對(duì)大腸桿菌，中性蛋白酶酶解物對(duì)沙門(mén)氏菌，胰蛋白酶酶解物對(duì)金黃色葡萄球菌均無(wú)抑菌活性。相比而言，木瓜蛋白酶酶解物對(duì)3種菌的抑菌效果均較好，與其他四種酶解物對(duì)3種菌的抑菌圈直徑存在顯著性差異(P<0.05)。因此，確定木瓜蛋白酶為山羊乳酪蛋白的最佳水解用酶。

圖1 菌液吸光值與其濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線

表2 山羊乳酪蛋白酶解物的抑菌效果(±s，n=3)

表2 山羊乳酪蛋白酶解物的抑菌效果(±s，n=3)

注：青霉素質(zhì)量濃度為1 250 mg/L；小寫(xiě)字母不同表示差異性顯著(P<0.05)；瓊脂孔直徑8.0 mm；-為沒(méi)有抑菌圈。

菌株大腸桿菌沙門(mén)氏菌金黃色葡萄球菌中性蛋白酶酶解物8.2±0.1c―8.3±0.2c胰蛋白酶酶解物8.4±0.2c 8.2±0.2c―木瓜蛋白酶酶解物9.3±0.2b 9.4±0.1b 9.4±0.3b抑菌圈直徑/mm菌株大腸桿菌沙門(mén)氏菌金黃色葡萄球菌堿性蛋白酶酶解物―8.4±0.1c 8.3±0.2c胃蛋白酶酶解物8.6±0.1c 8.5±0.2c―生理鹽水―――青霉素40.3±0.5a 43.3±0.5a 43.0±1.0a抑菌圈直徑/mm

2.2 木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 酶解時(shí)間

在酶解溫度為60℃，pH 值為5.5，加酶量為4 500 U/g，底物濃度為60 g/L的反應(yīng)體系下，改變酶解時(shí)間，不同酶解時(shí)間對(duì)酶解液抑菌效果的影響結(jié)果如圖2。

圖2 時(shí)間對(duì)山羊乳酪蛋白酶解物抑菌性影響

由圖2可以看出，在2.5 h之前，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解液對(duì)3種菌的抑菌圈直徑逐漸增大，說(shuō)明酶解時(shí)間小于2.5 h，酪蛋白沒(méi)有被完全水解，隨著水解時(shí)間的延長(zhǎng)水解度增加，具有活性的多肽濃度不斷升高；而2.5 h之后，抑菌圈的直徑隨時(shí)間延長(zhǎng)而減小，可能是因?yàn)槔业鞍妆煌耆夂?，具有抑菌活性的多肽被繼續(xù)酶解成不具抗菌活性小肽，使原來(lái)生成的抗菌肽的量減少。2.5 h時(shí)抑菌效果達(dá)到最高，說(shuō)明此時(shí)酶解液中抗菌肽濃度最高，為最佳酶解時(shí)間。

2.2.2 加酶量的影響

在給定條件酶解溫度60℃，底物質(zhì)量濃度60 g/L，酶解時(shí)間2.5 h，pH值為5.5時(shí)，加酶量對(duì)山羊乳酪蛋白酶解物抑菌活性影響如圖3所示。

圖3 加酶量對(duì)山羊乳酪蛋白酶解物抑菌性影響

由圖3可以看出，加酶量在2 000～5 000 U/g之間，酶解液對(duì)3種菌的抑菌圈直徑隨加酶量的增加而增大，在5 000 U/g之后，抑菌圈直徑隨加酶量的增加而減小。加酶量在5 000 U/g之前，隨著酶用量的增加，酶與底物的比例逐漸增大，單位時(shí)間內(nèi)木瓜蛋白酶結(jié)合酪蛋白并催化反應(yīng)生成的抗菌肽的量也逐漸增多；在5 000 U/g之后，隨著加酶量的增大，體系內(nèi)開(kāi)始形成酶多底物少的局面，一方面，蛋白酶之間形成競(jìng)爭(zhēng)關(guān)系，使酶解程度降低，另一方面未能與酪蛋白結(jié)合的酶會(huì)酶解水解產(chǎn)物，使抗菌肽的量減少，從而降低抑菌活性。加酶量為5 000 U/g時(shí)對(duì)3種菌的抑菌效果達(dá)到最高，為最適加酶量。

2.2.3 底物質(zhì)量濃度的影響

在酶解溫度為60℃，加酶量5 000 U/g，pH值為5.5的反應(yīng)體系下，酶解山羊乳酪蛋白2.5 h，底物質(zhì)量濃度對(duì)山羊乳酪蛋白酶解物抑菌活性影響如圖4所示。

圖4 底物質(zhì)量濃度對(duì)山羊乳酪蛋白酶解物抑菌性的影響

由圖4可以看出，在底物質(zhì)量濃度為40～80 g/L時(shí)，酶解物對(duì)3種菌的抑制作用隨底物質(zhì)量濃度的增加而增大，根據(jù)單底物酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)理論，底物質(zhì)量濃度較低時(shí)，酶解液水解程度隨底物質(zhì)量濃度增加而增大，水解產(chǎn)生的具有抗菌活性的多肽濃度增大，酶解液對(duì)3種菌抑菌作用也較大；而在底物質(zhì)量濃度大于80 g/L時(shí)，抑菌圈直徑減小，說(shuō)明當(dāng)?shù)孜镔|(zhì)量濃度超過(guò)80 g/L后，體系開(kāi)始出現(xiàn)底物抑制現(xiàn)象。因此，以80 g/L為最適底物質(zhì)量濃度。

2.2.4 pH值的影響

在酶解溫度60℃，酶解時(shí)間2.5 h，加酶量5 000 U/g和底物質(zhì)量濃度為80 g/L的條件下，pH值對(duì)酶解物抑菌活性的影響如圖5所示。

由圖5可以看出，隨著反應(yīng)體系內(nèi)pH值的增大，酶解物對(duì)3種菌的抑菌圈直徑呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在反應(yīng)體系中，酶解酪蛋白的水解酶的空間構(gòu)象受pH值的影響較大，在過(guò)酸過(guò)堿的環(huán)境下，水解酶的空間構(gòu)象會(huì)改變使其降低其活性，從而生成的抗菌肽的量也降低。因此，反應(yīng)體系最適合pH值確定為6.0。

圖5 pH值對(duì)羊乳酪蛋白酶解液抑菌活性的影響

2.2.5 木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的正交實(shí)驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)得到的最適條件，用L9(34)正交實(shí)驗(yàn)對(duì)加酶量、底物濃度、酶解時(shí)間和pH值進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，通過(guò)正交實(shí)驗(yàn)確定酶解山羊乳酪蛋白的最佳工藝條件。正交實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)與結(jié)果分析如表3所示。

表3中，R值最大的為pH值，其次為加酶量，然后是酶解時(shí)間，底物質(zhì)量濃度R值最小?？梢?jiàn)，實(shí)驗(yàn)中各因素對(duì)酶解產(chǎn)物抑菌活性的影響的主次順序?yàn)镈＞B＞A＞C，即pH值＞加酶量＞酶解時(shí)間＞底物質(zhì)量濃度。ki值顯示木瓜蛋白酶酶解山羊乳酪蛋白的最佳工藝組合為A1B2C2D2，即在60℃下，酶解時(shí)間為1.5 h，加酶量為5 000 U/g，底物質(zhì)量濃度8%，pH值為6.0，恰為正交實(shí)驗(yàn)第2組。

表3 木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的正交設(shè)計(jì)與結(jié)果分析

2.3 討論

(1)山羊乳酪蛋白的木瓜蛋白酶酶解物對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈分別為10.5 mm，10.3 mm和10.5 mm，這與一些牛乳酪蛋白酶解物的抑菌圈相比，直徑比較小，如胡志和等人利用胰蛋白酶解牛乳酪蛋白，獲得抗菌肽對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為19.5 mm[7]；付莉等人利用中性蛋白酶水解酪蛋白所得抗菌肽對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為21.93 mm[20]。這可能與本試驗(yàn)用于制備的酪蛋白為粗品(酪蛋白濃度為18.78%)，酶解底物純度較小有關(guān)。

(2)熊清權(quán)等人[21]利用木瓜蛋白酶酶解牛乳酪蛋白制備抗菌肽，確定酶解的最佳時(shí)間為4.5 h，而本試驗(yàn)最佳酶解時(shí)間為1.5 h，相差較大，這可能與山羊乳酪蛋白與牛乳酪蛋白自身性質(zhì)有關(guān)，Jainska研究表明，在體外用胰蛋白酶酶解酪蛋白，羊乳酪蛋白有96%被水解，而牛乳酪蛋白只水解了70%～90%[22]；在人的胃液和十二指腸液的作用下，30 min內(nèi)只有23%的羊乳酪蛋白未被水解，而牛乳酪蛋白還有83%未被水解[23]。說(shuō)明羊乳酪蛋白比牛乳酪蛋白存在更大的溶解性，更易被酶解。

表3木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的正交設(shè)計(jì)與結(jié)果分析。

(3)單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)結(jié)果相比，酶解時(shí)間不一致，單因素試驗(yàn)時(shí)最適酶解時(shí)間為2.5 h，而正交試驗(yàn)為1.5 h，這是因?yàn)樵谧鰡我蛩卦囼?yàn)時(shí)，首先考慮了酶解時(shí)間，加酶量、pH值和底物質(zhì)量濃度均為選酶時(shí)設(shè)定的初始條件，也就是說(shuō)2.5 h是在其他因素為初始條件下得到的較好的結(jié)果，與做正交試驗(yàn)時(shí)各因素的優(yōu)化條件不一樣，優(yōu)化試驗(yàn)證明，酶解1.5 h，酶解物抗菌效果更佳。

3 結(jié) 論

(1)木瓜蛋白酶是山羊乳酪蛋白的最佳水解用酶，其酶解物對(duì)沙門(mén)氏菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抑菌作用最強(qiáng)。

(2)木瓜蛋白酶水解山羊乳酪蛋白的最佳工藝為加酶量為5 000 U/g，底物質(zhì)量濃度80 g/L，pH值為6.0，在60℃酶解1.5 h，所得酶解液對(duì)沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的抑菌圈直徑均在10.5 mm左右。

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