煙草C3HC4型鋅指蛋白的原核表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株功能研究

伍文憲 楊秀芬 劉勇 邱德文

（1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，北京 100081；2. 四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，成都 610066）

鋅指蛋白是真核生物基因組中最豐富的一類轉(zhuǎn)錄因子，最初于1983年被發(fā)現(xiàn)存在于非洲爪蟾卵母細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄因子TFIIIA中［1]，鋅指結(jié)構(gòu)由多個半胱氨酸或（和）組氨酸組成，通過鋅離子來維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。鋅指蛋白通過與目的基因的DNA或RNA結(jié)合，或與其他蛋白之間的相互作用來調(diào)控基因表達(dá)。根據(jù)半胱氨酸（C）和組氨酸（H）殘基數(shù)及在蛋白中的位置，可將含鋅指結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子分為C2H2、C2C2、C3H、C3HC4（Zinc finger）和C3HC5（LIM finger）5個亞類［2]，C3HC4鋅指蛋白具有較為簡單的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)［3]，由能結(jié)合兩個離子的4對雙配體構(gòu)成，不僅能結(jié)合DNA，還能與RNA，蛋白質(zhì)和脂質(zhì)結(jié)合［4]。C3HC4鋅指蛋白參與基因轉(zhuǎn)錄與重組，細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等各種生命過程，也能在蛋白間互作以及泛素化進(jìn)程中發(fā)揮重要作用，許多C3HC4鋅指蛋白本身就是E3泛素化連接酶，介導(dǎo)泛素化目標(biāo)蛋白的轉(zhuǎn)移［5]。

植物C3HC4型鋅指蛋白基因的研究多集中在擬南芥與水稻［6]。為人們所熟知的擬南芥C3HC4型鋅指蛋白有AtCOP1（參與光反應(yīng)）、AtCIP8（參與光形態(tài)建成）［7]、AtTED3（參與光信號傳導(dǎo)）［8]、AtRMA1（參與分泌途徑）［9]、AtXB3（參與根的發(fā)育）［10]、AtSDIR1（抗逆反應(yīng)）［11]等。在水稻中，研究比較深入的C3HC4型鋅指蛋白大多與光形態(tài)建成有關(guān)，主要包括OsCOP1、OsCOIN1、OsXB3.1和OsRHC1［7]。目前，尚無對煙草中C3HC4型鋅指蛋白的研究報道，本研究以誘導(dǎo)植物抗性的蛋白激發(fā)子Hrip1為誘餌蛋白，從煙草cDNA文庫中首次獲得本生煙C3HC4型鋅指蛋白基因NbZFP1，建立該蛋白大腸桿菌體外重組表達(dá)系統(tǒng)，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株并分析轉(zhuǎn)化株的表型特征和抗病功能，以期為進(jìn)一步研究煙草C3HC4型RING鋅指蛋白在生長發(fā)育以及蛋白激發(fā)子誘導(dǎo)植物抗性分子機(jī)制中的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 本生煙種子由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.1.2 載體和菌株 原核表達(dá)載體pGEX-6P-2與pMAL-C2X、植物表達(dá)載體pBI121、農(nóng)桿菌菌株GV3101均由本實(shí)驗(yàn)室保存，TMV-GFP病毒由清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院劉玉樂教授提供，大腸桿菌感受態(tài)BL21購自北京全式金公司。

1.1.3 儀器與試劑 蛋白純化儀AKTA explorer 900（Amersham公司）；地高辛分子檢測試劑盒（Roche公司）；植物組織RNA提取試劑盒（北京全式金公司）；mRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京全式金公司）；各化學(xué)試劑均購自AMRESCO公司。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第一鏈的合成 采用植物組織RNA提取試劑提取本生煙總RNA，取2 μg mRNA用于cDNA第一鏈的合成（具體方法參見北京全式金公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書）。

1.2.2NbZFP1的克隆與序列測定 以從煙草cDNA文庫中獲得的一段約200 bp的序列為信息探針，搜索本生煙SGN mRNA序列庫，同源比較，設(shè)計一對特異性PCR引物：F-NbZFP1：5'-CG GGATCCATGTCACTTTCTGGTCGT-3'，R-NbZFP1：5'-GCGTCGACTCAGGTTTTCAGCCCTGT-3'（引物由北京華大公司合成）。PCR程序擴(kuò)增目的基因：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，55℃復(fù)性30 s，72℃延伸1 min，30個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。目的條帶經(jīng)膠回收純化后連接到pEASY-Blunt-Zero載體中，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞Trans5α，測序由北京華大公司完成。

1.2.3NbZFP1原核表達(dá)重組質(zhì)粒的構(gòu)建 質(zhì)粒提取、雙酶切、連接及轉(zhuǎn)化等參照試劑說明書和相關(guān)的分子生物方法［12]，簡要操作步驟如下：提取原核表達(dá)載體pGEX-6P-2、pMAL-C2X以及測序正確的pEASY-Blunt-Zero-NbZFP1轉(zhuǎn)化子質(zhì)粒，用限制性內(nèi)切酶BamH I和SalI雙酶切并回收載體片段及目的基因片段NbZFP1，22℃連接15 min后轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E. coliBL21（DE3）中，過夜培養(yǎng)，待長出單菌落，挑取單菌落為模板進(jìn)行菌落PCR，篩選出陽性轉(zhuǎn)化子后送測序，將驗(yàn)證無誤的轉(zhuǎn)化子分別命名為pGEX-6P-2-NbZFP1和pMAL-C2X-NbZFP1。

1.2.4NbZFP1蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)和檢測 挑取pGEX-6P-2-NbZFP1、pMAL-C2X-NbZFP1、pGEX-6P-2空載體和pMAL-C2X空載體單菌落，分別接種于50 mL含Amp（終濃度為100 μg/mL）的液體LB培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)6-7 h，按1∶100 的比例稀釋到1 L含Amp（100 μg/mL）新鮮液體LB培養(yǎng)基中，37℃ 220 r/min振蕩培養(yǎng)4 h，溫度調(diào)至16℃，轉(zhuǎn)速調(diào)至200 r/min，待溫度降至16℃后，加入終濃度為0.1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)過夜，次日將菌液分別轉(zhuǎn)入離心桶中，4℃，5 000 r/min 離心15 min，棄上清，向沉淀中加入40-50 mL pH8.0的Tris緩沖液重懸，之后進(jìn)行超聲破碎處理，待超聲波破碎完全，4℃，12 000 r/min離心50 min，取上清，用相應(yīng)的預(yù)裝親和層析柱初步純化，收集洗脫液以及穿透液，洗脫液經(jīng)脫鹽后，用蛋白純化儀AKTA explorer 900離子交換層析，收集各個洗脫峰。各個樣品通過變性聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）進(jìn)行分析。SDSPAGE試劑的配制及方法參照文獻(xiàn)［13] 。

1.2.5 目標(biāo)基因轉(zhuǎn)化煙草 利用Primer 5.0軟件設(shè)計1對特異性引物5'-CGATGTCACTTTCTGGTCGT-3'（下劃線為BamH I酶切位點(diǎn)）和5'-GCTCAGGTTTTCAGCCCTGT-3'（下劃線為SalI酶切位點(diǎn)）擴(kuò)增NbZFP1的開放閱讀框，連接至pEASY-Blunt-Zero載體中，之后用BamH I和SalI雙酶切，同時雙酶切載體pBI121，然后用T4 DNA連接酶連接獲得融合載體pBI121-NbZFP1，用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤浸染法［14]將融合載體pBI121-NbZFP1轉(zhuǎn)化到野生型本生煙中，葉盤置于培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/mL NAA+1 mg/mL BA+3%蔗糖+0.375% phytagel，pH5.7）2℃暗培養(yǎng)2 d，將葉盤轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/mL NAA+1 mg/mL BA+3%蔗糖+500 mg/mL頭孢霉素+100 mg/mL卡那霉素+0.375%phytagel，pH5.7），光照培養(yǎng)一個月左右，保持28-30℃，每10 d更換一次分化培養(yǎng)基，待分化出小苗后，將苗轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基（MS+0.1 mg/mL NAA+3%蔗糖+250 mg/mL頭孢霉素+80 mg/mL卡那霉素+0.375% phytagel，pH5.7），最終獲得轉(zhuǎn)基因煙草。

1.2.6 轉(zhuǎn)基因煙草的分子鑒定 用植物組織基因組DNA試劑盒（北京全式金公司）提取長勢較好的T0代轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA，以pBI121載體上一段1 000 bp左右特異性高的序列設(shè)計引物，PCR鑒定陽性植株。將陽性煙草植株做Southern雜交試驗(yàn)，Southern鑒定按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.2.7 株高及節(jié)間長的測定 溫室培養(yǎng)T0代陽性轉(zhuǎn)基因煙草，獲得T1代種子，分別在溫室中培養(yǎng)野生型本生煙與T1代轉(zhuǎn)基因本生煙，待長至四葉期后每隔10 d測量株高及節(jié)間長。

1.2.8 轉(zhuǎn)基因煙草抗病性測定 分別選取培養(yǎng)20 d左右的T1代轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草，在煙草中部葉片上用棉棒涂抹含TMV-GFP的PBS緩沖液，重復(fù)3次。3 d后在紫外燈下觀察發(fā)病情況［15]。

2 結(jié)果

2.1 NbZFP1的克隆

利用設(shè)計的特異性PCR引物，從本生煙的cDNA中擴(kuò)增了一條576 bp產(chǎn)物，命名為NbZFP1。同時將其克隆到平末端載體pEASY-Blunt-Zero中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans5α，獲得的轉(zhuǎn)化子經(jīng)菌落PCR及測序后，經(jīng)序列比對與數(shù)據(jù)庫中序列完全一致。

2.2 NbZFP1的原核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

原核表達(dá)載體pGEX-6P-2在其多克隆位點(diǎn)上游有一個谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶編碼序列，目的基因在不改變閱讀框架的條件下插入多克隆位點(diǎn)（MCS），在轉(zhuǎn)化大腸桿菌后經(jīng)過異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的誘導(dǎo)及相應(yīng)條件的優(yōu)化，就可表達(dá)出與谷胱甘肽-s-轉(zhuǎn)移酶融合的蛋白。將之前構(gòu)建好的克隆子用BamH I和SalI雙酶切并回收目的條帶后，與同樣使用BamH I和SalI雙酶切過的表達(dá)載體pGEX-6P-2連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，通過菌落PCR及測序驗(yàn)證陽性轉(zhuǎn)化子。

原核表達(dá)載體pMAL-C2X在其多克隆位點(diǎn)上游有一個麥芽糖結(jié)合蛋白編碼序列，設(shè)計引物時在反向引物添加6個組氨酸密碼子，這樣在誘導(dǎo)表達(dá)時C末端含6個His標(biāo)簽，可以用His親和層析柱純化。pMAL-C2X載體可以較高幅度的提高目標(biāo)蛋白的可溶性。pMAL-C2X-NbZFP1的構(gòu)建與pGEX-6P-2-NbZFP1一致。

2.3 NbZFP1的原核表達(dá)檢測

將構(gòu)建好的含有NbZFP1基因的原核表達(dá)載體pGEX-6P-2-NbZFP1、pMAL-C2X-NbZFP1和空白對照質(zhì)粒pGEX-6P-2、pMAL-C2X分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3），經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)親和層析，離子交換層析純化后，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分析，經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色成像。由于所克隆的基因約為576 bp，所以編碼蛋白分子量約為24 kD，表達(dá)載體pGEX-6P-2上的GST蛋白約26 kD，因此pGEX-6P-2-NbZFP1融合蛋白的分子量約為50 kD。而pMAL-C2X上的MBP標(biāo)簽蛋白約為45 kD，因此pMAL-C2X-NbZFP1融合蛋白的分子量為69 kD。SDS-PAGE結(jié)果（圖1，圖2）顯示，在預(yù)計的大小處有明顯的深染蛋白條帶，而空載對照只分別在25 kD和45 kD有條帶，說明已成功構(gòu)建了pGEX-6P-2-NbZFP1以及pMAL-C2X-NbZFP1基因原核表達(dá)載體，并在大腸桿菌中成功表達(dá)。

圖1 pGEX-6P-2-NbZFP1表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

圖2 pMAL-C2X-NbZFP1表達(dá)產(chǎn)物SDS-PAGE分析

2.4 轉(zhuǎn)NbZFP1基因的煙草植株獲得

將攜帶NbZFP1基因的過表達(dá)載體pBI-121-NbZFP1通過電擊法轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌GV3101中，利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法，侵染本生煙葉片，再經(jīng)共培養(yǎng)、分化培養(yǎng)后，將分化出的抗性苗剪下轉(zhuǎn)移至生根培養(yǎng)基中，4周左右得到生根的抗性苗。

選取野生型本生煙植株和在抗性培養(yǎng)基上生根的轉(zhuǎn)基因本生煙株系，用植物基因組DNA提取試劑盒提取煙草葉片基因組DNA。選取pBI121載體上特性較高的約1 000 bp的片段設(shè)計引物，結(jié)果（圖3）顯示，在18個煙草轉(zhuǎn)化株系中，8個轉(zhuǎn)化株系能穩(wěn)定擴(kuò)增出pBI121載體上一段1 000 bp左右特異性條帶，與陽性對照大小一致，初步說明NbZFP1基因已成功轉(zhuǎn)化煙草。

圖3 T0代轉(zhuǎn)基因煙草基因組DNA PCR擴(kuò)增結(jié)果

隨機(jī)挑選的3個PCR陽性的T0代植株用于Southern blot，均檢測到目的基因的整合，一個株系為單拷貝，兩個株系為多拷貝，而在非轉(zhuǎn)基因?qū)φ罩袥]有檢測到雜交條帶，說明NbZFP1已成功整合到煙草基因組（圖4）。

圖4 轉(zhuǎn)基因植株的Southern雜交鑒定結(jié)果

2.5 NbZFP1對三生煙表型及抗病性的影響

將單拷貝的T1代轉(zhuǎn)基因種子及野生型煙草種子分別培養(yǎng)于1/2MS培養(yǎng)基，生長1周左右，將幼苗移栽至土中，待四葉期后，每隔10 d分別測量野生型和轉(zhuǎn)基因煙草株高及節(jié)間長，直至第60天。結(jié)果（圖5-圖7）顯示，單拷貝T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株相對野生型有明顯矮化，株型緊湊，節(jié)間縮短。利用TMV-GFP接種于煙草后，通過TMV-GFP熒光強(qiáng)度分析判斷抗病能力的方法，將TMV-GFP分別接種于轉(zhuǎn)基因和野生型煙草中部葉面大小一致的葉片上，重復(fù)3次。3 d后在紫外燈下觀察，發(fā)現(xiàn)野生型煙草葉片上綠色熒光強(qiáng)度高于轉(zhuǎn)基因植株（圖8），說明單拷貝的轉(zhuǎn)NbZFP1基因植株抗病性強(qiáng)于野生型植株。

3 討論

圖5 T1代單拷貝轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草平均節(jié)間長比較

圖6 T1代單拷貝轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草不同時間株高比較

圖7 T1代單拷貝轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草

鋅指蛋白普遍存在于植物中，它們在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育及非生物應(yīng)答等多種重要的生命過程中起著不可替代的作用。目前，在植物中對鋅指蛋白家族的研究主要集中在C2H2型，對C3HC4型的研究比較少，尤其是對煙草C3HC4行鋅指蛋白的研究未見報道。本實(shí)驗(yàn)室利用酵母雙雜交技術(shù)篩選蛋白激發(fā)子Hrip1互作過程中，首次從煙草cDNA文庫中篩選到了一個C3HC4型鋅指蛋白，通過病毒介導(dǎo)的基因沉默（VIGS）技術(shù)發(fā)現(xiàn)該蛋白能影響煙草果實(shí)發(fā)育（另文發(fā)表）。本研究構(gòu)建了本生煙NbZFP1基因的原核表達(dá)載體，獲得了在大腸桿菌中大量表達(dá)不同標(biāo)簽的融合蛋白，同時利用親和層析、離子交換層析以及分子篩技術(shù)分離純化了不同NbZFP1融合蛋白，為進(jìn)一步研究該蛋白影響煙草果實(shí)發(fā)育的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時為今后利用不同技術(shù)研究蛋白互作，如GST-Pull down、免疫共沉淀、Biacore等提供了純化的蛋白樣品。

圖8 TMV-GFP侵染野生型及轉(zhuǎn)基因煙草后葉片情況

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因方法將NbZFP1基因在煙草植株中過表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單拷貝的T1代轉(zhuǎn)基因煙草植株表現(xiàn)出株型緊湊、節(jié)間縮短。這個結(jié)果與其他植物中所報道的鋅指蛋白功能上有相似之處，如矮牽牛中鋅指蛋白EPF家族基因，以及擬南芥中鋅指蛋白SUPERMAN、NNT 控制其生殖發(fā)育［16-18]，水稻鋅指蛋白基因PROG1在株型發(fā)育調(diào)控和馴化中起重要作用［19]，水稻鋅指蛋白基因OsZRL沉默后能對根系及植株的生長具有促進(jìn)作用［20]。在前人研究報道的基礎(chǔ)上，猜測NbZFP1可能是作為轉(zhuǎn)錄因子通過某種機(jī)制參與到生長素信號傳導(dǎo)或生長素/細(xì)胞分裂素信號傳導(dǎo)，從而影響煙草的生長發(fā)育，本研究得到的單拷貝轉(zhuǎn)基因植株為下一步研究該蛋白的分子機(jī)制提供了試驗(yàn)材料。

在擬南芥中，含有類LSD1（組蛋白賴氨酸特異性脫甲基酶）鋅指結(jié)構(gòu)域的LSD1相關(guān)蛋白參與抗病反應(yīng)和細(xì)胞程序性死亡，在水稻中，編碼鋅指蛋白的OsLOL2基因通過調(diào)節(jié)PR蛋白含量參與調(diào)控水稻的生長和抗?。?1]。推測本試驗(yàn)轉(zhuǎn)NbZFP1基因煙草可能也是通過上調(diào)PR基因達(dá)到抗病性增強(qiáng)目的。為此，作者將在下一步試驗(yàn)中驗(yàn)證NbZFP1基因是否參與相應(yīng)PR基因的表達(dá)。

4 結(jié)論

本研究以蛋白激發(fā)子Hrip1為誘餌蛋白，從煙草cDNA文庫中首次獲得本生煙C3HC4型鋅指蛋白，命名為NbZFP1。將該蛋白基因構(gòu)建于原核表達(dá)載體pGEX-6P-2及pMAL-C2X上并分別轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)得到大量可溶性重組蛋白，通過親和層析技術(shù)、離子交換層析等純化技術(shù)獲得了純度較高、性質(zhì)穩(wěn)定的GST-NbZFP1、MBP-NbZFP1蛋白。構(gòu)建植物表達(dá)體系，將NbZFP1基因轉(zhuǎn)化本生煙，經(jīng)Southern blot檢測獲得了單拷貝轉(zhuǎn)NbZFP1基因本生煙株系。與野生型煙草植株相比，T1代單拷貝轉(zhuǎn)基因植株株型緊湊、節(jié)間縮短、莖干粗壯。同時，NbZFP1基因過表達(dá)可以顯著提高植株對TMV的抗病性。

［1] Berg JM, Shi Y. The galvanization of biology：a growing appreciation for the roles of zinc ［J] . Science, 1996, 271：1081-1085.

［2] 劉強(qiáng), 張貴友.植物轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)構(gòu)與調(diào)控作用［J] .科學(xué)通報,2000, 45（14）：1465-1474.

［3] Joazeiro CA, Weissman AM. RING finger proteins：mediators of ubiquitin ligase activity ［J] . Cell, 2000, 102：549-552.

［4] Stone SL, Hauksdottir H, Troy A, et al. Functional analysis of the RING-type ubiquitin ligase family ofArabidopsis［J] . Plant Physiol,2005, 137：13-30.

［5] Ciechanover A. The ubiquitin-proteasome pathway：on protein death and cell life ［J] . EMBO J, 1998, 17：7151-7160.

［6] Saad RB, Zouari N, Ramdhan WB, et al. Improved drought and salt stress tolerance in transgenic tobacco overexpressing a novel A20/AN1 zinc-finger “AlSAP” gene isolated from the halophyte grassAeluropus littoralis［J] . Plant Mol Biol, 2010, 72：171-190.

［7] Von Arnim AG, Deng XW. Ring finger motif ofArabidopsis thalianaCOP1 defines a new class of zinc-binding domain ［J] . Biol Chem,1993, 268：19626-19631.

［8] Pepper AE, Chory J. Extragenic suppressors of theArabidopsisdet1 mutant identify elements of flowering-time and light-response regulatory pathways ［J] . Genetics, 1997, 145：1125-1137.

［9] Matsuda N, Suzuki T, Tanaka K, Nakano A. Rma1, a novel type of RING finger protein conserved fromArabidopsisto human, is a membrane-bound ubiquitin ligase ［J] . Cell Sci, 2001, 114：1949-1957.

［10] Wang YS, Pi LY, Chen XH, et al. Rice XA21 binding protein 3 is a ubiquitin ligase required for full Xa21-mediated disease resistance［J] . Plant Cell, 2006, 18：3635-3646.

［11] Zhang Y, Yang C, Li Y, et al. SDIR1 is a RING finger E3 ligase that positively regulates stress responsive abscisic acid signaling inArabidopsis［J] . Plant Cell, 2007, 19（6）：1912-1929.

［12] 薩姆布魯克丁, 弗里奇EF, 曼尼阿蒂斯T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南［M] .第2版.北京：科學(xué)出版社, 1989：34-74.

［13] 汪家政, 范明.蛋白質(zhì)技術(shù)手冊［M] .北京：科學(xué)出版社,2001.

［14] Anoop N, Gupta AK. Transgenic indica rice cvIR-50 overexpressingVigna aconitifoliadelta-1-pyrroline-5-carboxylae synthetase cDAN shows tolerance to high salt ［J] . Plant Biochem Biotechnol, 2003,12：109-116.

［15] Liu Y, Schiff M, Marathe R, Dinesh-Kumar SP. Tobacco Rar1,EDS1 and NPR1/NIM1 like genes are required for N-mediated resistance to tobacco mosaic virus ［J] . The Plant Journal, 2002,30（4）：415-429.

［16] Kobayashi A, Sakamoto A, Kubo K, et al. Seven zinc-finger transcription factors are expressed sequentially during the development of anthers in petunia ［J] . Plant J, 1998, 13（4）：571-576.

［17] Sakai H, Medrano LJ, Meyerowitz EM. Role of SUPERMAN in maintainingArabidopsisfloral whorl boundaries ［J] . Nature,1995, 378：199-203.

［18] Crawford BCW, Ditta G, Yanofsky MF. The NTT gene is required for transmitting-tract development in carpels ofArabidopsis thaliana［J] . Curr Biol, 2007, 17（13）：1101-1108.

［19] Jin J, Huang W, Gao JP, et al. Genetic control of rice plant architecture under domestication ［J] . Nat Genet, 2008, 40：1365-1369.

［20] 玉曉紅, 晁麗, 陳昌冬, 等.利用RNA干涉研究水稻鋅指蛋白基因OsZRL的功能［J] .中國水稻科學(xué), 2013, 27（1）：8-16.

［21] Bhatti KH, Xu C, Wu J, He C, et al. Over-expression of rice OsLOL2 gene confers disease resistance in tobacco toPseudomonassyringaepv. tabaci［J] . Progress in Natural Science, 2008, 18：807-812.