中間型高溫放線菌特異PCR快速鑒別方法的應用

張明娟 姚粟 李輝 劉洋 信春暉 許玲 程池

（1.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院 中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心，北京 100015；2.山東扳倒井股份有限公司，高青 256300）

中間型高溫放線菌（Thermoactinomyces intermedius）最早由Kurup于1981年發(fā)現(xiàn)，屬于細菌域（Eubacteria）-厚壁菌門（Firmicutes）-芽孢桿菌綱（Bacilli）-芽孢桿菌目（Bacillales）-高溫放線菌科（Thermoactinomycetaceae）-高溫放線菌屬（Thermoactinomyces），嗜高溫，能產(chǎn)生豐富的菌絲和內(nèi)生孢子［1，2]，常見于自然界的高溫環(huán)境中。目前高溫放線菌屬中僅有3個有效種，即普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgaris）、中間型高溫放線菌（Thermoactinomyces intermedius）［2]和2013年發(fā)表的新種Thermoactinomyces daqus［3]，該屬中的中間型高溫放線菌具有生產(chǎn)耐熱、光穩(wěn)定的亮氨酸脫氫酶和苯丙氨酸脫氫酶的能力，這兩個酶可以作為某些治癌藥物合成的中間體，在制藥工業(yè)上有重要的應用［4，5]。近年來，在芝麻香型白酒釀造微生物研究中發(fā)現(xiàn)中間型高溫放線菌菌種為高溫大曲中的優(yōu)勢菌種，其代謝產(chǎn)物對芝麻香型白酒特殊風味物質(zhì)形成具有不可忽視的作用［6-8]，但目前尚無中間型高溫放線菌與芝麻香型白酒風味物質(zhì)形成的相關(guān)研究報道。故中間型高溫放線菌在芝麻香型白酒釀造中作用還有待進一步研究。

因此，對高溫大曲等高溫環(huán)境中中間型高溫放線菌菌株的篩選鑒別具有重要實踐意義。然而，中間型高溫放線菌與其近緣種之間在形態(tài)學特征、生理生化特征及16S rRNA基因序列方面均十分接近，應用常規(guī)技術(shù)鑒別繁瑣費時，無法滿足中間型高溫放線菌的篩選及其應用研究的要求，目前仍需建立一套準確、快速的中間型高溫放線菌菌種鑒別方法，為其應用研究提供菌種資源。

gyrB基因即促旋酶（gyrase）的B亞單位基因，作為蛋白編碼基因，其所固有的遺傳密碼子的兼并性使得DNA序列可以發(fā)生較多的變異而不改變氨基酸序列，這就使得gyrB基因序列在區(qū)分和鑒定細菌近緣種方面，比非蛋白編碼基因16S rDNA有更高的分辨率［9]。因此，本研究利用中間型高溫放線菌gyrB序列，設(shè)計了中間型高溫放線菌的種特異性PCR引物，建立了一套快速篩選中間型高溫放線菌的特異PCR方法，并將其應用于芝麻香型白酒高溫大曲中間型高溫放線菌的篩選，以期可快速獲得大量中間型高溫放線菌菌株，旨為后續(xù)研究奠定菌種基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgarisDSM 43016T），普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgarisACCC 41061T），普通高溫放線菌（Thermoactinomyces vulgarisZM60），甘蔗萊西氏菌（Laceyella sacchariDSM 43356T），惡臭萊西氏菌（Laceyella putidusDSM44608T），Thermoactinomyces daqusCICC 10681T，中間型高溫放線菌（Thermoactinomyces intermediusDSM 43816T），地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformisCICC 10101T），Laceyella tengchongensisCCTCC AA 208050T，Laceyella sediminisCCTCC AA 2011024T，芝麻香型白酒高溫大曲中分離的25株高溫細菌。

1.1.2 試劑TaqDNA聚合酶、dNTP、DL 2000 Marker、100 bp Marker購自天為時代生物有限公司；GoldView購自北京塞百盛基因技術(shù)有限公司；溶菌酶購自Sigma公司、蛋白酶K購自Merk公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自Tiangen公司。

1.1.3 培養(yǎng)基 ISP2培養(yǎng)基：4 g/L葡萄糖，4 g/L酵母提取物，10 g/L麥芽提取物，固體培養(yǎng)基則添加20 g/L瓊脂。NA培養(yǎng)基：蛋白胨5 g/L，牛肉膏3 g/L，氯化鈉5 g/L，固體培養(yǎng)基則添加20 g/L瓊脂。胰蛋白酶東酵母提取物：胰蛋白胨大豆肉湯30 g/L，酵母提取物3 g/L，固體培養(yǎng)基則添加20 g/L瓊脂。

1.2 方法

1.2.1 細菌培養(yǎng)T.vulgarisDSM 43016T，T.vulgarisACCC 41061T，L.sacchariDSM 43356T，L.putidusDSM44608T，L.tengchongensisCCTCC AA 208050T，L.sediminisCCTCC AA 2011024T，T.daqusCICC 10681T均用ISP2培養(yǎng)基55℃培養(yǎng)1 d；T.intermediusDSM 43816T用胰蛋白酶東酵母提取物培養(yǎng)基55℃培養(yǎng)1 d；B.licheniformisCICC 10101T用NA培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)1 d；T.vulgarisZM60和25株芝麻香型白酒高溫大曲中分離的高溫細菌用NA培養(yǎng)基55℃培養(yǎng)1 d。

1.2.2 細菌DNA提取 利用細菌基因組DNA提取試劑盒提取供試菌株的DNA，具體方法參見說明書。

1.2.3 特異PCR方法建立

1.2.3.1 引物設(shè)計 根據(jù) GenBank數(shù)據(jù)庫中中間型高溫放線菌gyrB基因序列，設(shè)計了1對特異性引物，將引物用BLAST軟件于互聯(lián)網(wǎng)上進行比對，每條引物在本種內(nèi)相同，種間具有差異，以此保證引物的種內(nèi)通用、種間特異。引物序列見表1，引物由北京諾賽基因組研究中心合成。

表1 中間型高溫放線菌特異引物序列

1.2.3.2 PCR反應體系和反應程序確定 以T.intermediusDSM 43816T的基因組DNA為模板，利用設(shè)計好的種特異性引物進行 PCR擴增。經(jīng)過多輪條件優(yōu)化后，建立適宜的PCR 反應體系和反應程序。

PCR 反應體系：10×Taqreaction buffer 5.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，10 μmol/L 的dNTP 4.0 μL，2.5 U的Taq酶0.6 μL，DNA模板1.0 μL，dd H2O 37.4 μL。

PCR反應程序為：95℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃復性30 s，72℃延伸80 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.3.3 引物特異性驗證 以T. vulgarisDSM 43016T，T. vulgarisACCC 41061T，T. vulgarisZM60，L. sacchariDSM 43356T，L. putidusDSM44608T，T. daqusCICC 10681T，T. intermediusDSM 43816T，B. licheniformisCICC 10101T，L. tengchongensisCCTCC AA 2080-50T，L. sediminisCCTCC AA 2011024T的基因組DNA為模板，利用所設(shè)計的特異引物進行PCR擴增。PCR反應體系和程序見1.2.3.2。

1.2.4 芝麻香型白酒高溫大曲中中間型高溫放線菌篩選 以25株芝麻香型白酒高溫大曲中分離的高溫細菌為模板，利用所設(shè)計的特異引物進行擴增。PCR反應體系和程序見1.4.3.2。

2 結(jié)果

2.1 特異PCR方法建立

2.1.1 PCR反應體系和反應程序確定 以T.intermediusDSM 43816T的基因組DNA為模板，利用設(shè)計好的種特異性引物及優(yōu)化后的PCR反應體系和反應程序進行 PCR擴增，擴增結(jié)果應用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果（圖1）顯示，本研究所設(shè)計的引物和優(yōu)化的PCR反應體系、反應程序可以從T.intermediusDSM 43816T的基因組DNA中擴增出576 bp的DNA片段。

圖 1 PCR產(chǎn)物檢測

2.1.2 引物特異性驗證 以參考菌株的基因組DNA為模板，利用特異引物78F/618R進行PCR擴增，PCR反應體系和程序見1.2.3.2。擴增結(jié)果（圖2）顯示，僅有T. intermediusDSM 43816擴增出長約576 bp的清晰單一條帶，與預期產(chǎn)物大小一致，其余9株細菌及陰性對照無單一條帶。

因此，本試驗設(shè)計的特異性引物78F/618R分別對物對中間型高溫放線菌具有很好的種特異性，且所采用的PCR反應體系和反應程序適合進行中間型高溫放線菌快速鑒別。

圖 2 PCR產(chǎn)物檢測

1.2.3 芝麻香型白酒高溫大曲中中間型高溫放線菌篩選 以25株芝麻香型白酒高溫大曲中分離的高溫細菌為模板，利用所設(shè)計的特異引物進行擴增。擴增結(jié)果（圖3）顯示：有HHH-8、HHH-10、HHH-13、HHH-15、HHH-20、HHH-2、QQ2、QQ3、QQ4、QQ5、QQ6，QQ7、QQ8、QQ9、ZQ18-4和H-7共16株菌擴增出長約576 bp的DNA片段，與預期產(chǎn)物大小一致，其余9株菌無條帶，此次共獲得16株中間型高溫放線菌菌株。本試驗僅經(jīng)過DNA提取、PCR擴增、凝膠電泳檢測3個步驟，就可從高溫細菌中篩選獲得中間型高溫放線菌菌株，節(jié)約了大量時間和成本。

3 討論

目前微生物鑒別通常是將微生物的形態(tài)特征、生理生化特征、化學特征以及分子生物學特征進行有機整合，得出最終結(jié)論［10]，這一方法是目前細菌分類鑒定最準確可靠的方法。但是其實驗通常繁瑣耗時，對于菌株篩選大量并不適合，特異性PCR技術(shù)卻為解決這一難題提供了捷徑，特異PCR技術(shù)是目前快速準確鑒定菌種的方法之一，它是根據(jù)物種rDNA上可變區(qū)或編碼基因的特有序列設(shè)計引物，進行物種鑒定的方法［11]。該方法因其簡便快捷，已經(jīng)廣泛應用于菌株篩選鑒別、食品檢測等各個研究領(lǐng)域，如本研究組劉勇等根據(jù)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌基因組中β-甘露聚糖酶基因設(shè)計了3對種特異引物，通過特異PCR方法能夠有效區(qū)分枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌和解淀粉芽孢桿菌［12]。商蓓等［13]根據(jù)蘋果黑星病菌與其他蘋果病原真菌核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列間差異設(shè)計了1對特異性引物，用于蘋果黑星病菌的分子檢測，實現(xiàn)了蘋果黑星病菌的快速檢測。特異PCR方法在這些領(lǐng)域的應用使其在微生物鑒別、病原微生物檢測方面可節(jié)約大量的時間和成本。本研究所建立的中間型高溫放線菌特異PCR方法快速鑒別方法可從高溫大曲中快速篩選出大量中間型高溫放線菌菌種，與傳統(tǒng)篩選鑒定方法相比，更加高效、廉價，十分有利于后期高溫大曲中的中間型高溫放線菌功能性研究，以及該菌種與芝麻香型白酒風味形成關(guān)系的研究。

圖 3 25株高溫細菌特異PCR產(chǎn)物檢測

4 結(jié)論

本研究根據(jù)中間型高溫放線菌gyrB基因設(shè)計的特異性引物具有較好的特異性，能快速高效實現(xiàn)中間型高溫放線菌與其它近緣種的區(qū)分，所建立的特異PCR方法適合快速篩選出中間型高溫放線菌菌種，與傳統(tǒng)的篩選鑒定方法相比，具有高效、靈敏、便捷及成本低廉等顯著優(yōu)點。

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