地龍的定性鑒別及蛋白質(zhì)含量測(cè)定

卓 燊 廖澤勇

地龍的定性鑒別及蛋白質(zhì)含量測(cè)定

卓 燊2廖澤勇1

目的 對(duì)地龍進(jìn)行定性鑒別及蛋白質(zhì)含量測(cè)定。方法采用顯微、薄層色譜法對(duì)地龍進(jìn)行定性鑒別，采用紫外分光光度法對(duì)其蛋白質(zhì)含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果蛋白質(zhì)在0.02～0.10mg/m l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，在50min內(nèi)穩(wěn)定性良好，測(cè)得地龍蛋白質(zhì)含量為2.33mg/g，儀器精密度RSD為0.627 %。結(jié)論利用顯微及薄層鑒別，可對(duì)地龍藥材進(jìn)行定性鑒別及含量測(cè)定，蛋白質(zhì)含量采用紫外測(cè)定方法簡(jiǎn)便可行。

地龍；定性鑒別；蛋白質(zhì)；

地龍（Geosaurus）為環(huán)節(jié)動(dòng)物門鉅蚓科動(dòng)物參環(huán)毛蚓Pheretimaas pergilum（E Perrier）、威廉環(huán)毛蚓P guillelmi（M ichaelsen）、櫛肓毛蚓P pectinifera M ichaelsen或通俗環(huán)毛蚓P vulgarisChen的干燥體。前一種習(xí)稱“廣地龍”，后三種習(xí)稱“瀘地龍”，主產(chǎn)于福建、廣東、廣西等地；性寒，味咸；功效為清熱定驚，平肝熄風(fēng)，通絡(luò)利尿平喘；用于關(guān)節(jié)麻痹，高熱神昏，肢體麻木，驚癇抽搐，半身不遂，肺熱喘咳等。

地龍化學(xué)成分種類繁多，結(jié)構(gòu)復(fù)雜，多為高分子有機(jī)化合物[1-2]，主要化學(xué)成分為蛋白質(zhì)類。蛋白質(zhì)、氨基酸類成分可通過電泳分析、儀器分析等方法進(jìn)行含量測(cè)定；而目前化學(xué)成分、藥理等方面的研究相對(duì)較少。近年有研究使用地龍治療支氣管哮喘、癲癇發(fā)作、腮腺炎、高血壓、消化性潰瘍等而獲效的報(bào)道，是中醫(yī)藥治療心腦血管疾病、高熱驚厥、支氣管哮喘的良藥[3]。

1 儀器與試劑

1.1 儀器HH-6恒溫水浴鍋（江蘇金壇市宏華儀器廠）；顯微鏡BA-200（廈門麥克奧迪有限公司）；UV-紫外分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器公司）；電子天平、離心機(jī)、KQ-500DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑地龍（廣州致信中藥飲片有限公司）；地龍對(duì)照藥材（昆明雙星科技開發(fā)有限公司）；考馬斯亮藍(lán)G-250；牛血清白蛋白；試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 地龍的顯微分析按照2010版中國(guó)藥典的方法，將地龍藥材進(jìn)行粉碎處理，取少量粉末置于載玻片上，滴加水合氯醛，加熱透化，再滴加稀甘油裝片，在顯微鏡（目鏡6×，物鏡40×）下觀察，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1。

地龍粉末呈灰黃色，顯微鏡實(shí)驗(yàn)結(jié)果：①剛毛呈黃棕色或淡棕色，前端多頓圓，表面或可見縱裂紋；②斜紋肌纖維，淡棕色或無色，散離或相互交結(jié)，彎曲或稍平直，邊緣常不平整；③表皮黃棕色，細(xì)胞界限明顯，暗棕色色素顆粒散在或聚成網(wǎng)狀。

2.2 地龍的薄層分析

2.2.1 方法一 取地龍粉末 3g，加乙醇 30m l，水浴加熱回流 30min，放冷濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?0m l使溶解，用石油醚15m l振搖萃取，分取石油醚層，置水浴上蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇1m l使溶解，作為供試品溶液。另取地龍對(duì)照藥材0.3g，加乙醇10m l，同法制得對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2010版一部附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（9.0:0.5）為展開劑，展開，取出晾干，噴以10%硫酸-乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖2所示。

2.2.2 方法二 取地龍粉末3g，加氯仿30m l，超聲處理 3min，濾過，濾液置水浴上蒸干，殘?jiān)勇确?m l溶解，作為供試品溶液。另取地龍對(duì)照藥材0.3g，加氯仿10m l，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法（中國(guó)藥典2010版一部附錄Ⅵ B）試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各5μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-丙酮（9:1）為展開劑，展開，取出晾干，噴以10%硫酸-乙醇溶液，熱風(fēng)吹至斑點(diǎn)顯色清晰，置紫外光燈（365nm）下檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3～4所示。

圖1 地龍粉末顯微圖

圖2-4 10%硫酸-乙醇顯色TLC圖(溫度：20℃，濕度：65%)

圖2為供試品與對(duì)照藥材在相應(yīng)的位置上顯相同紫紅顏色的主斑點(diǎn)。圖3～4在365nm紫外熒光檢測(cè)下，供試品與對(duì)照藥材在相應(yīng)的位置上顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)；10 %硫酸-乙醇溶液薄層板上，供試品與對(duì)照藥材在相應(yīng)位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)。

2.3 地龍的蛋白質(zhì)檢測(cè)取地龍粉末 3g，用冷水30m l浸提（每毫升含原藥材100mg），適當(dāng)濃縮后，取浸提液點(diǎn)樣于硅膠 G薄層板上，以正丁醇-冰醋酸-水（4:1:5）（上層）為展開劑，展開，取出晾干，噴以0.5%茚三酮溶液顯色，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示。

地龍薄層分析顯紫紅至深藍(lán)斑點(diǎn)，表明地龍藥材中含有大量蛋白質(zhì)氨基酸類成分。

圖5 0.5%茚三酮溶液顯色TLC圖

2.4 地龍的蛋白質(zhì)含量測(cè)定

2.4.1 供試液的制備 稱取地龍藥材30g，加10倍量水，浸泡40min，煎煮3次，每次60min，過濾后合并濾液，將濾液濃縮至適量，放置過夜，離心，定容成50m l備用[4-5]。

2.4.2 對(duì)照品及試劑的配制 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液：稱取50mg牛血清白蛋白，加50m l蒸餾水容成1mg/m l溶液?？捡R斯亮藍(lán) G-250蛋白試液：稱取100mg考馬斯亮藍(lán)G-250，溶于50m l 95%乙醇中，加入85%的磷酸100m l，用蒸餾水定容成1000m l[6]。

2.4.3 線性關(guān)系考察 在各試管中分別加入濃度為0.00、0.02、0.04、0.06、0.08、0.10mg/m l的蛋白質(zhì)溶液，再各加入5m lG-250試劑充分搖勻，放置2min后在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。以標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線為 Y=4.8214X+0.0034，R2=0.9997，表明標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)在0.02～0.10mg/m l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（表1）。

表1 蛋白溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4.4 精密度測(cè)定 精密吸取 0.6mg/m l的牛血清白蛋白溶液100μl，加入5m l G-250試劑充分搖勻，放置2min后在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。連續(xù)測(cè)定6次。實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD為0.627%，表明儀器精密度良好（表2）。

2.4.5 穩(wěn)定性考察 精密吸取0.6mg/m l的牛血清白蛋白溶液100μl，加入5m l G-250試劑充分搖勻，放置2min后在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。每10min測(cè)一次，測(cè)定50min內(nèi)的吸光度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果RSD為2.57%，表明蛋白質(zhì)溶液在50min內(nèi)性質(zhì)穩(wěn)定（表3）。

表2 精密度測(cè)定

表3 穩(wěn)定性考察

2.4.6 樣品含量測(cè)定 于3支試管中分別準(zhǔn)確加入已稀釋10倍的0.1m l樣品蛋白液，再各加5m l考馬斯亮蘭G-250試劑，充分混合，放置2min后，以標(biāo)準(zhǔn)曲線0號(hào)試管做參比，在595nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值。計(jì)算得出蛋白質(zhì)含量（表4）。

經(jīng)樣品含量測(cè)定，地龍水溶性蛋白質(zhì)的含量（以牛血清白蛋白計(jì)）為2.33mg/g。

表4 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 小結(jié)

本研究顯示，利用顯微鑒別法和薄層鑒別法可對(duì)地龍藥材進(jìn)行定性鑒別及含量測(cè)定，蛋白質(zhì)含量采用紫外測(cè)定方法簡(jiǎn)便可行。

[1] Eue I,KausChke E,Mohrig W,et al.Isolation and character ization of earthworm Hemolysins and Agg Lutinins[J].Developmental & Comparative Immunology,1998,22(1):23-25.

[2] Kazuo K,Makoto Y,Masahiko O,et al.Perfo rin in earthw orm coelomocytes[J].Developmental & Comparative Immunology,1998, 22(1):133-134.

[3] 王本祥.現(xiàn)代中藥藥理學(xué)[M].天津:天津科學(xué)技術(shù)出版社,1997: 1104-1104.

[4] 高華宏,劉昌,王文瓊,等.正交試驗(yàn)法優(yōu)選廣地龍?zhí)崛」に嘯J].湖北中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2004,6(3):31-32.

[5] 李廷利,李玉萍,馮翰.地龍的化學(xué)成分與臨床應(yīng)用概況[J].黑龍江醫(yī)藥,2006,19(4):303-304.

[6] 邱葵,司天潤(rùn).用考馬斯亮藍(lán)測(cè)定動(dòng)物藥材中可溶性蛋白質(zhì)含量方法初探[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志,2007,14(4):49-50.

[7] 呂金勝,吳畏,孟德勝,等.地龍醇提物抗炎及鎮(zhèn)痛作用的研究[J].中國(guó)藥師,2003,6(1):16-18.

[8] 鄧少偉,馬雙成.用大孔吸附樹脂分離川芎總提物[J].中草藥, 1999,30(1):23-24.

Qualitative Identification and Determ ination of Protein Content of Geosaurus

Zhuo Shen Liao Zeyong

Ob jec tive To do qua litative identification and determ ination of p rotein content of Geosaurus.MethodsWe used the m icroscopy、TLC and UV spectrophotometry methods to prove the identification and determ ine the p rotein o f Geosaurus.Resu ltThe p rotein was linear in the range of 0.02～0.10m g/m l.The stability of p rotein was fine in 50m in.The protein content of geosaurus was 2.33mg/g and RSD was 0.627%.Conc lusionUse of the methods of m icroscopy、TLC can identify Geosaurus.UV m ethods o f p rotein content o f Geosaurus is easy and feasib le.

Geosaurus;Qualitative Identification;Protein

R927.2

A

1673-5846(2014)05-0018-03

1廣西藥用植物園，廣西南寧 530023

2廣西科技大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣西柳州 545005

卓燊（1975-），主管中藥師，碩士研究生，研究方向：中藥藥效與理論。

廖澤勇（1984-），初級(jí)研究員，碩士研究生，研究方向：中藥藥效學(xué)。