種群密度和食物密度變化對蒙古裸腹溞產(chǎn)雄的誘導(dǎo)效應(yīng)

趙滿意，王偉洪，張健兵，鐘愛華，儲張杰，樓 寶

（1.浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316100）

蒙古裸腹溞是目前唯一可在海水中大量培養(yǎng)的鹽水枝角類[1]，作為鹵蟲的替代產(chǎn)品，其在海水魚苗培育中的應(yīng)用和生產(chǎn)性培養(yǎng)正日益受到重視。種群的數(shù)量變動理論上是出生率與死亡率的變動，其中出生率與生殖量、種群性比等指標(biāo)相關(guān)，因此，雄體產(chǎn)生機理和誘導(dǎo)因素的研究，是研究枝角類等生物餌料種群數(shù)量動態(tài)變化機理和規(guī)模化培養(yǎng)研究的重要內(nèi)容。一般認為，枝角類孤雌生殖和兩性生殖兩種生殖方式均與環(huán)境條件相關(guān)[2-5]，但至今關(guān)于枝角類的生殖機制研究不多，尤其是兩性生殖機理很不清楚。相關(guān)的前期研究表明[1]，蒙古裸腹溞的雄體來源于母體的產(chǎn)出，進行孤雌生殖的母體在良好環(huán)境條件（溫度、鹽度和食物等適宜，低溞密度條件）下，產(chǎn)出的幼體幾乎都是孤雌生殖雌體，產(chǎn)雄率極低，而隨著溞密度的上升及溫度和餌料密度等因子的改變，產(chǎn)雄率變化很大。本研究在這些相關(guān)研究基礎(chǔ)上，著重研究較高溫度條件下（25～30℃），種群密度和食物密度變化對蒙古裸腹溞產(chǎn)雄的誘導(dǎo)效應(yīng)，以期進一步掌握蒙古裸腹溞的繁殖特性，并為蒙古裸腹溞的規(guī)?；囵B(yǎng)和枝角類生殖生理等研究提供參考資料。

1 材料與方法

1.1 溞種來源

實驗溞種由上海海洋大學(xué)生理生態(tài)重點實驗室提供，源于1982年采自晉南地區(qū)半咸水湖，在浙江海洋學(xué)院水產(chǎn)養(yǎng)殖實驗室內(nèi)以海水連續(xù)孤雌生殖繁衍保存下的溞種。

1.2 實驗條件與餌料

實驗在 RXZ 人工氣候箱內(nèi)進行，設(shè)定溫度為（28±0.5）℃，光照 3 000～4 000 lx，光暗周期（L：D）為 12：12；鹽度27.5±0.5；培養(yǎng)液由實驗條件下培養(yǎng)至指數(shù)生長期的海水小球藻Chlorella sp.配制而成。

1.3 實驗設(shè)計和方法

1.3.1 實驗設(shè)計

實驗設(shè)初始溞數(shù)量為1 ind/mL（低溞密度）、3 ind/mL（中溞密度）、6 ind/mL（高溞密度）三個水平，按培養(yǎng)液更換間隔設(shè)固定和機動兩組，固定組設(shè)1次/12 h和1次/6 h更換培養(yǎng)液兩組，機動組是藻液更換次數(shù)視藻液濾淡（清）情況而定。各實驗組均設(shè)3個重復(fù)。

1.3.2 實驗用溞

實驗用溞均為實驗條件下，0.2 ind/mL密度下4 h內(nèi)產(chǎn)出的同齡幼體。在更換的藻液密度 (3～4)×106cells/ml，24 h更換培養(yǎng)液一次的實驗條件下，選取單個培養(yǎng)連續(xù)3個世代以上的溞1個，產(chǎn)出第一窩幼溞后，移走母溞，培養(yǎng)幼溞，并以同樣方法，始終控制培養(yǎng)密度在0.2 ind/mL以下，擴大培養(yǎng)至第一窩產(chǎn)出幼溞能滿足實驗用溞數(shù)量需要。實驗開始時，選取在4 h內(nèi)基本同步產(chǎn)出的幼溞，挑至1只1 000 mL燒杯中混合，然后再用吸管隨機吸至各實驗組。

1.3.3 實驗方法

實驗均在50 mL燒杯中進行，控制培養(yǎng)容積誤差（50±5）mL，溞密度為低、中、高各處理初始實驗組幼溞數(shù)分別為50個、150個、300個，培養(yǎng)液（藻液）更換密度均為(3～4)×106cells/mL。每次產(chǎn)幼前，及時隨機抓取育兒囊高起快產(chǎn)幼的溞10個，放至空白燒杯繼續(xù)培養(yǎng)至幼體全部產(chǎn)出后，將母溞放回原燒杯，計數(shù)產(chǎn)出幼溞總數(shù)和其中的雄體數(shù)，另在固定1次/12 h各溞密度組產(chǎn)第一窩時，隨機抓取育兒囊高起快產(chǎn)幼的溞27個（即每個燒杯抓取3個母溞），在空白燒杯中1杯1個培養(yǎng)至幼體全部產(chǎn)出后，將母溞放回原燒杯，計數(shù)產(chǎn)出幼溞總數(shù)和其中的雄體數(shù)。實驗至第四窩雌雄鑒別后結(jié)束。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

窩產(chǎn)幼數(shù)=每窩產(chǎn)出幼體數(shù)

總產(chǎn)幼數(shù)=每窩產(chǎn)出幼體數(shù)之和

窩生殖量=每窩產(chǎn)出幼體數(shù)/（存活溞總數(shù)-形成的兩性生殖雌體數(shù)）

窩雄體百分率=每窩產(chǎn)出幼體中的雄體數(shù)/每窩產(chǎn)幼數(shù)(窩生殖量)×100%

平均雄體百分率=累計產(chǎn)出幼體中的雄體數(shù)/累計產(chǎn)幼總數(shù)(總生殖量)×100%

窩平均產(chǎn)出時間=Σ(次產(chǎn)幼數(shù)×次產(chǎn)幼時間)/窩產(chǎn)幼數(shù)，次產(chǎn)幼數(shù)指每次觀察時已產(chǎn)出的幼體數(shù)，次產(chǎn)幼時間均取相鄰檢查記錄時間的中值

雄體產(chǎn)出效率=(累計)產(chǎn)幼總數(shù)×(平均)雄體百分率/平均產(chǎn)出時間×1 000 mL/50 mL(ind/d·L)，指 1 L水體平均每天產(chǎn)出的雄體數(shù)；其中，平均產(chǎn)出時間=Σ(次產(chǎn)幼數(shù)×次產(chǎn)幼時間)/累計產(chǎn)幼總數(shù)

實驗數(shù)據(jù)方差分析取P＜0.05為差異顯著標(biāo)準，均值比較均按Duncan法分析。

2 結(jié)果

2.1 不同培養(yǎng)條件下的雄體產(chǎn)出率

至第4窩產(chǎn)幼結(jié)束，不同培養(yǎng)條件下的平均雄體產(chǎn)出率范圍為0.14%～13.01%，以溞密度3 ind.ml-1×培養(yǎng)液更換1次/12 h組最高，溞密度1 ind/mL×培養(yǎng)液機動更換組最低。從圖1和圖2可以看出，平均產(chǎn)雄率，相同培養(yǎng)液更換條件下，不同溞密度間差異較大，以中溞密度（3 ind/mL）最高，高溞密度（6 ind/mL）其次，低溞密度（1 ind/mL）最低；而在相同溞密度條件下，以固定組1次/12 h最高，固定組1次/6 h和機動組則差異不大，約為固定組1次/12 h的50%左右。從圖3可知，不同培養(yǎng)液更換條件，固定組1次/12 h和1次/6 h均表現(xiàn)為中溞密度＞高溞密度＞低溞密度規(guī)律，尤以固定組1次/12 h的差異更明顯，機動組則表現(xiàn)為隨溞密度降低而降低規(guī)律，而在不同溞密度下，中、低溞密度時均表現(xiàn)為固定組1次/12 h＞固定組1次/6 h＞機動組規(guī)律，高溞密度時則表現(xiàn)為機動組﹥固定組1次/12 h＞固定組1次/6 h。方差分析結(jié)果表明，溞密度和培養(yǎng)液更換方式對平均產(chǎn)雄率有較強的交互作用。

圖1 不同培養(yǎng)液更換方式下至第4窩的平均雄體百分率Fig.1 Average male ratio of 4 broods neonates in different algae replace

圖2 不同溞密度下至第4窩的平均雄體百分率Fig.2 Average male ratio of 4 broods neonates in different population density

圖3 不同培養(yǎng)條件下至第4窩的平均雄體百分率Fig.3 Average male ratio of 4 broods neonates in different experimental combination

2.2 不同培養(yǎng)條件下的窩雄體產(chǎn)出率

由表1可知，不同培養(yǎng)條件下，第1窩均有雄體產(chǎn)出，且窩產(chǎn)雄率差異極大，變動范圍 0.54%～29.00%，以溞密度 3 ind/mL、培養(yǎng)液更換1次/12 h組最高，溞密度1 ind/mL、培養(yǎng)液機動更換組最低；第2窩只有部分組別有雄體產(chǎn)出，且產(chǎn)出率遠低于或低于同組別第1窩，而第3、第4窩各組別均未發(fā)現(xiàn)有雄體產(chǎn)出。

由表2可知，在27個單個母溞的第1窩產(chǎn)出幼體中，有13個母溞產(chǎn)出幼體全部都是雌體（雄體產(chǎn)出率為0），占全部母溞的48.15%；其他14個都有雄體產(chǎn)出，占全部母溞的51.85%，窩雄體產(chǎn)出率最高可達60.00%，最低16.67%，其中高于或等于50%的有3個，40%～49%的有2個，30%～39%的有3個，低于30%的6個，但沒有1個母溞1窩產(chǎn)出幼體是全雄的。

表1 不同培養(yǎng)條件下的窩雄體百分率（%）Tab.1 Male ratio of different broods in different experimental combination（%）

表2 固定組1次/12 h×3 ind/mL組合的第1窩幼體數(shù)和雄體數(shù)Tab.2 The number of neonates and males in the first brood of 1times/12 h×3 ind/mL combination

2.3 不同培養(yǎng)條件下的雄體產(chǎn)出效率

由于雄體的產(chǎn)出主要集中于第1窩，第3窩和第4窩均未有雄體產(chǎn)生，不同培養(yǎng)條件下的雄體產(chǎn)出效率基本上都隨培養(yǎng)時間增加而降低。由表4可知，至第一窩產(chǎn)出，雄體產(chǎn)出效率范圍為0.15～7.78 ind/（d·L），以固定組1次/12 h×3 ind/mL組合最高，機動組×6 ind/mL組合其次，機動組×1 ind/mL組合最低，至第4窩產(chǎn)出，最高的固定組1次/12 h×3 ind/mL組合從7.78 ind/（d·L）下降到3.52 ind/（d·L）。

從圖4可以看出，至第4窩的平均雄體產(chǎn)出效率，相同溞密度時，高溞密度下，培養(yǎng)液更換兩固定組差異不顯著，機動組顯著高于二者；低溞密度下，三組均較低，機動組接近于0，兩固定組略高于機動組且兩者差異不顯著；中溞密度下，三組相對均較高，其中固定組1次/6 h與機動組差異不顯著，但固定組1次/12 h遠高于二者；相同培養(yǎng)液更換方式下，兩組固定組均表現(xiàn)為中溞密度時最高，高溞密度和低溞密度均較低且兩者間差異不顯著，而機動組則表現(xiàn)為隨溞密度降低而顯著降低。

3 討論

3.1 蒙古裸腹溞的產(chǎn)雄特性

曹文清等[6]通過染色體組型研究發(fā)現(xiàn)，蒙古裸腹溞的幼體在育兒囊中已產(chǎn)生雌雄性分化，即雄體在胚胎發(fā)育期形成，但胚胎發(fā)育的雌雄性分化是卵的差異還是胚胎發(fā)育過程中受外界環(huán)境因素誘導(dǎo)所致，目前尚不清楚。關(guān)于枝角類雄體產(chǎn)生的機理，是內(nèi)部因素控制的生存對策，還是環(huán)境因子的誘導(dǎo)作用，抑或兩者的共同作用，不同學(xué)者間存在分歧[8-18]。在本研究實驗用溞制備過程中，檢測單個母溞的窩生殖量和產(chǎn)雄率時發(fā)現(xiàn)，窩生殖量8～13個，產(chǎn)出幼體幾乎都是孤雌生殖雌體，偶有雄體發(fā)現(xiàn)，即在很低溞密度和相對較高藻密度情況下，有個別母溞可有雄體產(chǎn)出，但產(chǎn)出率極低。依據(jù)本研究實驗結(jié)果，作者初步分析認為，蒙古裸腹溞雄體的產(chǎn)出應(yīng)與母溞個體有關(guān)，不同個體產(chǎn)雄率的差異主要在于個體差異和誘導(dǎo)因素強弱，排入育兒囊的不同卵之間可能不同質(zhì)，即可能存在基因型及卵的大小、卵黃含量多少等差異，不同卵在胚胎發(fā)育時也可能不均等，這些因素都可能導(dǎo)致初生幼溞的個體差異，由此，不同個體在生長發(fā)育過程中對外界環(huán)境條件的反應(yīng)敏感性有一定差異，從而導(dǎo)致相同條件下個體間存活率、壽命、生殖量、產(chǎn)雄率等差異。

表3 不同培養(yǎng)條件下的雄體產(chǎn)出效率Tab.3 Efficiency of male reproduction in different experimental combination

圖4 不同培養(yǎng)條件下至第4窩的雄體產(chǎn)出效率Fig.4 Efficiency of male reproduction in different experimental combination

在本研究檢測的27個母溞中，有48.15%的母溞一窩幼體是全雌的，但沒有1個母溞一窩幼體是全雄的，這與盧芳野[7]等在食物不足、低溞密度及擁擠水等條件下，出現(xiàn)雄體的72窩中，全是雄體的窩數(shù)占65%的研究結(jié)果完全不同。處理本研究實驗數(shù)據(jù)時發(fā)現(xiàn)，不同培養(yǎng)條件下的平均窩生殖量表現(xiàn)為隨溞密度增加而下降，隨培養(yǎng)液更換次數(shù)增加而增加，變動范圍2.14～6.02個，在溞密度6 ind/mL-1、培養(yǎng)液更換1次/12 h組合中，平均窩生殖量已降至2～3個，但也沒有發(fā)現(xiàn)有產(chǎn)全雄的窩數(shù)。蒙古裸腹溞是否具產(chǎn)全雄窩次特性及單依賴溞密度和藻密度波動是否能誘導(dǎo)蒙古裸腹溞產(chǎn)全雄窩次尚有待進一步研究。至于同一個體第2窩之后產(chǎn)雄率的降低或不產(chǎn)雄，作者認為這可能是母溞的環(huán)境適應(yīng)性所致，環(huán)境因子誘導(dǎo)母溞產(chǎn)出雄體必定與母溞對環(huán)境因子的敏感性有關(guān)，母溞從自身產(chǎn)出到產(chǎn)第一窩幼體處于幼齡至成齡生長發(fā)育期，是發(fā)育的關(guān)鍵階段，可能對環(huán)境因子的變化較敏感，從而易導(dǎo)致雄體產(chǎn)生，而從第二窩起則都是成齡生長期，經(jīng)歷幼齡期的環(huán)境適應(yīng)后，母溞對環(huán)境因子的敏感性可能已下降或已不敏感，處于“相對適宜”的環(huán)境條件狀態(tài)而使產(chǎn)雄率下降或不產(chǎn)雄。改變環(huán)境因子的強度是否能提高母溞第2窩以后的雄體產(chǎn)出率尚有待進一步研究。

3.2 不同培養(yǎng)條件下蒙古裸腹溞的產(chǎn)雄率與產(chǎn)雄效率

本研究中，窩產(chǎn)雄率指每窩產(chǎn)出幼體中的雄體百分率，與每窩中的雄體產(chǎn)出數(shù)和產(chǎn)出幼體總數(shù)即窩生殖量相關(guān)，反映一定條件下的單窩產(chǎn)雄特性；平均產(chǎn)雄率是指至第4窩產(chǎn)幼結(jié)束時累計產(chǎn)出幼體中的累計雄體百分率，反映整個生殖過程的產(chǎn)雄特性。本研究結(jié)果表明，不同培養(yǎng)條件下，蒙古裸腹溞雄體的產(chǎn)出基本集中于第1窩，第2窩至第4窩產(chǎn)出雄體數(shù)大幅下降或無，4窩的平均產(chǎn)雄率隨窩次增加而降低，這反映在特定培養(yǎng)群體中的雄體比率必然隨培養(yǎng)時間波動，在種群增長前期很低，快速增長期和相對生長下降期相對較高，相對穩(wěn)定期則又較低。

雄體產(chǎn)出效率，即1 L水體平均每天產(chǎn)出的雄體數(shù)，由單位時間內(nèi)的累計產(chǎn)幼總數(shù)、平均雄體百分率和平均產(chǎn)出時間等因素決定。檢測過程發(fā)現(xiàn)，中、高溞密度下有4%～11.89%的母溞轉(zhuǎn)化形成兩性生殖雌體，低溞密度下則無或偶有產(chǎn)生，這導(dǎo)致中、高溞密度下實際可產(chǎn)幼孤雌生殖母溞數(shù)下降。另外，從表4可知，幼體的平均產(chǎn)出時間有隨溞密度增加而增加，隨培養(yǎng)液更換次數(shù)增加而降低趨勢，在第1窩生殖時差異基本不顯著，至第2窩最大差異1.55 d，至第4窩則可達近3 d的差異。低溞密度時窩產(chǎn)雄率和平均產(chǎn)雄率低，高溞密度時可產(chǎn)幼孤雌生殖母溞數(shù)和窩生殖量均下降，產(chǎn)幼總數(shù)降低，同時幼體平均產(chǎn)出時間增加等，由此，雄體產(chǎn)出效率在中溞密度時相對較高，而雄體產(chǎn)出基本集中于第1窩的特性，使雄體產(chǎn)出效率隨培養(yǎng)時間增加而降低。

3.3 溞密度和藻密度對蒙古裸腹溞產(chǎn)雄的誘導(dǎo)效應(yīng)

本研究結(jié)果充分表明溞密度和藻密度波動是誘導(dǎo)蒙古裸腹溞雄體產(chǎn)生的兩個重要因素。對雄體產(chǎn)出率，溞密度和培養(yǎng)液更換方式兩者有較強交互作用，低溞密度下，不同培養(yǎng)液更換方式下均很低，但中、高溞密度時則與培養(yǎng)液更換方式相關(guān)。作者分析認為，溞種群的密度效應(yīng)包含溞個體間的碰撞頻率和代謝分泌物濃度效應(yīng)，與溞種群的數(shù)量、個體大小、運動能力與強度等有關(guān)，并受溫度、光強、藻密度等因素影響，而在固定更換藻液密度條件下，培養(yǎng)液更換方式實質(zhì)影響的是藻密度的波動大小、溞群體代謝分泌物濃度變化及培養(yǎng)液pH等整體環(huán)境因子，使這些因子呈現(xiàn)周期性動態(tài)變化規(guī)律，培養(yǎng)液更換間隔越短，波動越小，間隔越長，波動越大，其中，影響最大的是藻密度的波動幅度。由于溞群體的濾食效應(yīng)和藻細胞的生長繁殖，低溞密度下，溞群體的濾食效應(yīng)與藻細胞的生長繁殖速度可能差異不大，在一個更換期內(nèi)藻密度的波動均較小，而高溞密度下，溞群體的濾食效應(yīng)強于藻細胞的繁殖速度，在一個更換期內(nèi)，藻密度波動程度較大，固定組1次/12 h二次更換期間有3～6 h的藻液濾清時間，固定組1次/6 h在第一次產(chǎn)幼前培養(yǎng)液更換前后藻密度變化不大，之后也有較大的下降。相關(guān)研究表明[10-18]，溞密度和食物密度對枝角類個體的呼吸率、消化率、攝食強度及活動和代謝等一系列生命活動有一定影響，目前尚未有相關(guān)證據(jù)表明這是溞密度和藻密度誘導(dǎo)蒙古裸腹溞雄體產(chǎn)生的內(nèi)在機理，但根據(jù)本研究結(jié)果可以推論，增加溞密度和藻密度波動幅度均有提高蒙古裸腹溞雄體產(chǎn)出率的效應(yīng)。

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