秋水仙堿誘導(dǎo)藥用植物多倍體的研究進(jìn)展

劉露穎　趙喜亭　李明軍

摘要：本文對(duì)秋水仙堿誘導(dǎo)藥用植物多倍體的誘導(dǎo)方法、影響多倍體誘導(dǎo)效果的因素及目前存在的問(wèn)題進(jìn)行了綜述，為進(jìn)一步開展秋水仙堿誘導(dǎo)藥用植物提供依據(jù)。

關(guān)鍵詞：秋水仙堿；藥用植物；多倍體；研究進(jìn)展

中圖分類號(hào)： S567.035.2 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）04-0178-03

收稿日期：2013-08-20

基金項(xiàng)目：中國(guó)博士后科學(xué)基金（編號(hào)：2011M500457）；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金（編號(hào)：2011JS076）；河南省教育廳自然科學(xué)研究計(jì)劃（編號(hào)：2010A180015）。

作者簡(jiǎn)介：劉露穎（1988—），女，河南信陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事藥用植物生物技術(shù)研究。E-mail：liuluying2007@163.com。

通信作者：李明軍，博士，教授。E-mail：limingjun2002@263.net。多倍體植物是指具有3套或3套以上完整染色體組的個(gè)體[1]。由于其染色體數(shù)目加倍，個(gè)體常表現(xiàn)出營(yíng)養(yǎng)器官變大、抗逆能力增強(qiáng)等特征，在生物進(jìn)化與育種上具有重要意義。人們從植物資源中獲取食品、藥物及其他多種工業(yè)原料。目前世界各國(guó)對(duì)天然藥物需求和開發(fā)的不斷增加，使藥用植物面臨著日益嚴(yán)重的資源危機(jī)，尤其是以營(yíng)養(yǎng)器官為藥材的藥用植物資源危機(jī)更為嚴(yán)重。因此在有限的資源條件下，如何增加以收獲營(yíng)養(yǎng)器官為主的藥用植物的產(chǎn)量就成為研究的重點(diǎn)。多倍體藥用植物的獲得就成為主要途徑，因?yàn)槎啾扼w的營(yíng)養(yǎng)器官較正常植株大，且染色體是在原來(lái)基礎(chǔ)上整套加倍，不會(huì)造成原有藥用化學(xué)成分的丟失，相反會(huì)使原有藥用化學(xué)成分顯著增加[2-3]。多倍體誘導(dǎo)常用化學(xué)方法，所用的化學(xué)藥劑主要有秋水仙堿、水合三氯乙醛、笑氣、富民隆等。其中秋水仙堿只阻礙細(xì)胞分裂中期紡錘絲的形成，使細(xì)胞中與微管相關(guān)的功能受到阻礙和喪失，使有絲分裂被迫中斷[4]，但細(xì)胞和細(xì)胞質(zhì)并不分離從而導(dǎo)致同源染色體數(shù)目加倍，形成同源多倍體，其對(duì)染色體的結(jié)構(gòu)并無(wú)太大影響，在遺傳上也很少出現(xiàn)其他不利的變異[1]。因此秋水仙堿被廣泛應(yīng)用，其誘導(dǎo)效果也較其他化學(xué)藥劑好。因此本文對(duì)近年來(lái)秋水仙堿在誘導(dǎo)藥用植物多倍體上的應(yīng)用進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1秋水仙堿誘導(dǎo)方法

秋水仙堿誘導(dǎo)藥用植物多倍體的方法有活體誘導(dǎo)法和離體誘導(dǎo)法兩種。

1.1活體誘導(dǎo)

活體誘導(dǎo)一般有浸種法、生長(zhǎng)點(diǎn)滴定法、涂抹法3種方法。近十年來(lái)秋水仙堿活體誘導(dǎo)藥用植物的例子見表1。

1.1.1浸種法浸種法，就是將植物種子完全浸入到適當(dāng)濃度的秋水仙堿溶液中，在適宜溫度下處理適宜時(shí)間獲得多倍體植株的方法。這種方法適用于以種子為繁殖材料的藥用植物，已在甘草種子[5]、菘藍(lán)種子[6]、牛蒡種子[7]、羅漢果種子[8]、新疆雪蓮種子[9]上進(jìn)行了研究（表1）。研究發(fā)現(xiàn)此法雖然簡(jiǎn)單易操作，但誘導(dǎo)率低，變異植株出現(xiàn)嵌合體的現(xiàn)象較嚴(yán)重，如甘草種子經(jīng)0.20%秋水仙堿處理24 h，誘導(dǎo)率僅為3.33%，且獲得的變異植株均為四倍體的嵌合體[5]；菘藍(lán)種子和牛蒡種子經(jīng)適當(dāng)濃度的秋水仙堿處理適宜時(shí)間后，雖然能獲得較高的誘導(dǎo)率（菘藍(lán)種子為37.5%、牛蒡種子為400%），但獲得的多倍體植株也均為嵌合體[6-7]。另外，這種方法使植物種子直接暴露在秋水仙堿溶液中，因此加大了秋水仙堿對(duì)植株的毒性作用，造成種子萌發(fā)和根系生長(zhǎng)困難，且死亡率高，羅漢果種子用0.1%的秋水仙堿浸泡48 h后就開始出現(xiàn)毒害現(xiàn)象[8]；用秋水仙堿浸泡新疆雪蓮種子獲得的絕大部分變異植株，其根系在生長(zhǎng)后期因秋水仙堿的毒害作用而受損，無(wú)法吸收營(yíng)養(yǎng)，最終導(dǎo)致死亡[9]。

2.1外植體

外植體的來(lái)源是影響秋水仙堿誘導(dǎo)效果的一個(gè)很重要的因素。在秋水仙堿處理植物體細(xì)胞染色體加倍試驗(yàn)中，外植體一般為愈傷組織、種子、芽、胚狀體、莖尖分生組織、試管苗及由花柄、葉片、花莖組織培養(yǎng)所得的原球莖[35]。此外，也有花粉[36]。不同植物誘導(dǎo)多倍體的適宜外植體不同[35]。天山雪蓮的適宜外植體為無(wú)菌苗[24]；南丹參的適宜外植體為葉片，誘導(dǎo)率可達(dá)33.33%[29]。在對(duì)百合的研究中發(fā)現(xiàn)，與鱗片[37]、無(wú)菌試管苗[38]、叢生芽[23]相比，不定芽是最為適宜的外植體，誘變率達(dá)50.0%[39]。另外，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)外植體的發(fā)育時(shí)期也是影響誘導(dǎo)效果的一個(gè)重要因素。種子和芽可以在休眠狀態(tài)或代謝旺盛時(shí)期進(jìn)行處理，但生長(zhǎng)點(diǎn)處理時(shí)期越早，獲得的多倍體數(shù)目愈多，處理時(shí)間愈晚，則大多數(shù)出現(xiàn)嵌合體[40]。

2.2秋水仙堿濃度及處理時(shí)間

秋水仙堿的濃度和處理時(shí)間是影響染色體加倍的最重要的外在條件。用秋水仙堿處理時(shí)，植物種類不同，其濃度和處理時(shí)間的最佳組合不同[41]。以浸泡法為例，非洲菊染色體加倍的適宜濃度和時(shí)間組合是0.1%、8 h[42]；毛泡桐染色體加倍的適宜濃度和時(shí)間組合是0.05%、48 h[43]；長(zhǎng)春花染色體加倍的適宜濃度和時(shí)間組合是0.2%、24 h[44]；桉樹染色體加倍的適宜濃度和時(shí)間組合是0.21%、26.2 h[45]；盾葉薯蕷微塊莖加倍的適宜濃度和時(shí)間組合是0.15%、24 h[46]；懷地黃染色體加倍的適宜濃度和時(shí)間組合是0.1%、24 h[27]。菊花腦種子進(jìn)行染色體加倍誘導(dǎo)的適宜濃度和時(shí)間組合是 50 mg/L、48 h[40]；藥用百合叢生芽進(jìn)行染色體加倍誘導(dǎo)的適宜濃度和時(shí)間組合是0.1%、72 h[23]；庫(kù)拉索蘆薈試管苗進(jìn)行多倍體誘導(dǎo)的適宜濃度和時(shí)間組合是0.06%、12 h，而對(duì)其莖段、葉片進(jìn)行秋水仙堿棉球覆蓋處理時(shí)，0.02%的秋水仙堿處理48 h為最適宜的濃度和時(shí)間組合[25]。這可能是由于不同來(lái)源的外植體對(duì)秋水仙堿的反應(yīng)、耐受能力及敏感程度不同所致。

3存在問(wèn)題與展望

雖然在細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中，秋水仙堿能夠阻止紡錘體的形成而使染色體加倍，但隨著研究的進(jìn)一步深入，用秋水仙堿誘導(dǎo)藥用植株染色體加倍還存在著一些亟待解決的問(wèn)題。endprint

首先，毒害問(wèn)題。秋水仙堿對(duì)藥用植株的毒害作用主要表現(xiàn)在：抑制種子的萌發(fā)、根的生長(zhǎng)和不定芽的分化，甚至使材料在處理過(guò)程中死亡，另外處理后外植體在繼代培養(yǎng)中也容易褐化死亡。因此在處理藥用植物材料過(guò)程中篩選出最適宜的秋水仙堿濃度及處理時(shí)間顯得尤為關(guān)鍵，在保證誘導(dǎo)效果的情況下應(yīng)盡量減少秋水仙堿用量，縮短材料與秋水仙堿的接觸時(shí)間。

其次，嵌合體現(xiàn)象。由于分生組織細(xì)胞分裂的不同步性，用秋水仙堿處理后并不是所有細(xì)胞都可以加倍為多倍體，染色體未加倍的細(xì)胞與加倍的細(xì)胞嵌合在一起就形成了嵌合體。由于嵌合體現(xiàn)象嚴(yán)重，使得真正同一倍性的多倍體頻率過(guò)低，嚴(yán)重制約了藥用植物多倍體育種的發(fā)展。要從嵌合體中篩選出多倍體，可從形態(tài)上篩選出與正常植株有顯著差異的多倍體葉片等材料，通過(guò)組培手段獲得再生植株；或?qū)ζ渲仓赀M(jìn)行分離繁殖、多次繼代培養(yǎng)等方法消除嵌合體；也可直接將嵌合體解離為單個(gè)細(xì)胞，進(jìn)行單細(xì)胞培養(yǎng)，再將判定為多倍體的單細(xì)胞挑出后直接再生形成植株。

因?yàn)槎啾扼w的產(chǎn)生受外植體的生長(zhǎng)狀態(tài)、倍性水平，以及秋水仙堿的處理時(shí)間、濃度、溫度和滲透劑等因素的影響，要使秋水仙堿誘導(dǎo)成為藥用植物多倍體育種的一項(xiàng)成熟技術(shù)，還需要在更多的藥用植物上開展廣泛的研究。

盡管秋水仙堿在藥用植物多倍體誘導(dǎo)上還存在一些問(wèn)題，但其在藥用植物的多倍體育種工作中也取得了較大的進(jìn)展，獲得了一些抗逆性強(qiáng)、品質(zhì)優(yōu)的多倍體新品種[12-14]。隨著秋水仙堿誘導(dǎo)多倍體方法的成熟，以及與現(xiàn)代生物技術(shù)相結(jié)合，其在緩解藥用植物種質(zhì)退化、培育優(yōu)質(zhì)藥用植物品種等方面將會(huì)發(fā)揮更大的作用。

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