犬腹瀉病原菌的分離鑒定及藥物敏感性分析

李淑紅等

摘要：對(duì)湖南常德地區(qū)5例犬腹瀉病直腸糞便采樣，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定；用世界衛(wèi)生組織（WHO）推薦的Kirby-Bauer氏法對(duì)分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選抗致病菌的敏感藥物。結(jié)果表明，5例樣本中分離鑒定出4株沙門(mén)氏菌、5株大腸埃希菌，分離率分別為44.44%、55.56%。分離株沙門(mén)氏菌對(duì)新霉素、卡那霉素、妥布霉素、復(fù)方新諾明、慶大霉素等5種藥物敏感，對(duì)多黏菌素B、四環(huán)素2種藥物中介，對(duì)其余10種藥物耐藥；分離株大腸埃希菌對(duì)紅霉素、妥布霉素、復(fù)方新諾明3種藥物敏感，對(duì)卡那霉素、呋喃妥因、多黏菌素B、慶大霉素4種藥物中介，對(duì)其余10種藥物耐藥。

關(guān)鍵詞：犬；大腸埃希菌；沙門(mén)氏菌；分離；藥敏試驗(yàn)

中圖分類(lèi)號(hào)：S858.292.51 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1002-1302（2014）04-0170-02

收稿日期：2013-07-19

基金項(xiàng)目：湖南省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（編號(hào)：2008）；2011年湖南省“十二五”重點(diǎn)建設(shè)學(xué)科項(xiàng)目（編號(hào)：2011）；湖南省高校創(chuàng)新平臺(tái)開(kāi)放基金（編號(hào)：10K043）；湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（編號(hào)：2012）；湖南省科學(xué)技術(shù)廳計(jì)劃項(xiàng)目（編號(hào)：2013FJ3018）；湖南省常德市科技局項(xiàng)目（編號(hào)：2013NK02）。

作者簡(jiǎn)介：李淑紅（1964—），女，山東禹城人，碩士，教授，從事動(dòng)物科學(xué)專(zhuān)業(yè)教學(xué)與研究。E-mail：wangren6332@163.com。腹瀉是臨床上多種疾病經(jīng)過(guò)中表現(xiàn)的主要癥狀之一，是具有腹瀉癥狀疾病的統(tǒng)稱(chēng)，可導(dǎo)致犬營(yíng)養(yǎng)不良、生長(zhǎng)發(fā)育障礙和工作能力喪失，幼齡犬發(fā)生率和死亡率均很高[1]。病犬表現(xiàn)排便次數(shù)明顯增多，糞便稀薄如水樣或稀粥樣。由細(xì)菌引起犬腹瀉較常見(jiàn)，犬的腸道內(nèi)有大量潛在的致病菌，但不是每種細(xì)菌都與臨床疾病有明確的聯(lián)系。引起犬腸道感染的致病菌包括腸致病性大腸埃希菌、無(wú)致病性大腸埃希菌、沙門(mén)氏菌屬病菌、小腸結(jié)腸炎耶爾森菌、彎曲菌屬病菌、毛狀芽孢桿菌、梭菌屬病菌、葡萄球菌和志賀菌屬病菌[2]。其中，以大腸埃希菌最常見(jiàn)，其次為犬沙門(mén)氏菌，沙門(mén)氏菌病別稱(chēng)副傷寒，是由沙門(mén)氏菌屬細(xì)菌引起的人畜共患病[3]。本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)5例犬腹瀉病糞便進(jìn)行采樣、分離鑒定、革蘭氏染色鏡檢、生化試驗(yàn)，并對(duì)分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，篩選抗致病菌的敏感藥物，為臨床用藥和治療犬腹瀉病提供參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1藥品牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、氫氧化鈉、蒸餾水、無(wú)菌水；結(jié)晶紫、番紅、碘液、香柏油、二甲苯、95%乙醇等。11種腸埃希菌屬細(xì)菌生化編碼鑒定管由浙江省杭州微生物試劑有限公司生產(chǎn)。營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、麥康凱培養(yǎng)基（MAC）、伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB）、SS瓊脂培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂（BS）成品均由浙江省杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)；營(yíng)養(yǎng)肉湯（NB）、革蘭氏染色試劑由微生物實(shí)驗(yàn)室配制。

1.1.2藥敏紙片藥敏紙片為浙江省杭州天和微生物試劑有限公司采用美國(guó)NCCLS最新藥敏試驗(yàn)法規(guī)制備的標(biāo)準(zhǔn)厚紙片，直徑6.35 mm，紙片含藥量符合標(biāo)準(zhǔn)。本試驗(yàn)共選用17種藥物敏感試紙，包括新霉素（新）、羧芐青霉素（羧）、氨芐青霉素（氨）、頭孢拉定（VI）、卡那霉素（卡）、先鋒霉素V（V）、阿莫西林（莫）、四環(huán)素（四）、紅霉素（紅）、萬(wàn)古霉素（萬(wàn)）、妥布霉素（妥）、復(fù)方新諾明（復(fù)）、呋喃妥因（呋）、萘啶酸（萘）、鏈霉素（鏈）、慶大霉素（慶）、多黏菌素B（多）。

1.1.3主要儀器電子天平、生物顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、立式壓力蒸汽滅菌器、干燥箱、無(wú)菌操作臺(tái)、微量移液器等。

1.1.4病料來(lái)源湖南省常德市城西寵物醫(yī)院提供5只腹瀉犬，其中有3只絲毛犬、1只中華田園犬、1只小型獵犬。

1.2方法

1.2.1培養(yǎng)基配制營(yíng)養(yǎng)肉湯的配制：稱(chēng)量10 g蛋白胨、5 g牛肉膏、5 g氯化鈉，混合溶解于1 000 mL蒸餾水中并煮沸，校正pH值至7.0～7.2，裝于錐形瓶中經(jīng)121 ℃滅菌 15 min，冷藏備用[4]。營(yíng)養(yǎng)瓊脂（NA）、麥康凱培養(yǎng)基（MAC）、伊紅-美藍(lán)培養(yǎng)基（EMB）、SS瓊脂培養(yǎng)基、亞硫酸鉍瓊脂（BS）成品按說(shuō)明配制，備用。

1.2.2病料的采集用無(wú)菌棉拭子插入病犬直腸，旋轉(zhuǎn)取其糞便，迅速放入裝有滅菌營(yíng)養(yǎng)肉湯的5支試管內(nèi)，封蓋貼標(biāo)簽，放入37 ℃恒溫箱中增菌培養(yǎng)18～24 h。

1.2.3細(xì)菌的分離培養(yǎng)取少量用肉湯培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h的菌液，在NA培養(yǎng)基上劃線分離，置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng) 18～24 h，再挑取單菌落在普通瓊脂培養(yǎng)基上劃線分離、培養(yǎng)。如此反復(fù)，直到培養(yǎng)基上的菌落特征相同時(shí)，再挑取單個(gè)菌落涂片，染色并鏡檢[5]，觀察菌體大小、染色特征；并分別接種于EMB、MAC、SS、BS培養(yǎng)基上，觀察菌落生長(zhǎng)、形態(tài)、顏色、色澤、大小等。

1.2.4生化試驗(yàn)將疑似大腸埃希菌和沙門(mén)氏菌的細(xì)菌接種到細(xì)菌生化測(cè)定成套試劑微量管中，37 ℃恒溫箱培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄結(jié)果。

1.2.5藥敏試驗(yàn)選用17種藥物敏感試紙，采用目前各實(shí)驗(yàn)室廣泛采用的世界衛(wèi)生組織推薦的紙片瓊脂擴(kuò)散法（disc agar diffusion）即Kirby-Barere法，挑取1/2個(gè)已分離鑒定的菌落接種于含5 mL營(yíng)養(yǎng)肉湯的試管中，置37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，取出，與麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管進(jìn)行比較。若肉湯濁度不夠，則繼續(xù)培養(yǎng)；若肉湯濁度過(guò)高，則用滅菌生理鹽水稀釋調(diào)節(jié)至與0.5麥?zhǔn)蠘?biāo)準(zhǔn)管濁度相同。取直徑90 mm的平皿，瓊脂厚度約4 mm，用移液槍取菌液200 μL于營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中心，用刮鏟從中心開(kāi)始推平菌液，使菌液遍布培養(yǎng)皿的每個(gè)角落，用鑷子夾取藥敏紙片，每隔2 cm輕貼于培養(yǎng)基上，完成后于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)18～24 h，用游標(biāo)卡尺測(cè)量抑菌圈直徑，重復(fù)3次，記錄結(jié)果[6]。根據(jù)被測(cè)藥物按常用劑量、給藥時(shí)間在體內(nèi)能達(dá)到的血藥濃度將敏感性標(biāo)準(zhǔn)分為3級(jí)：敏感（S）、中介（I）和耐藥（R）?？咕幖埰N類(lèi)、含藥量及判定標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]（表1）。endprint

2結(jié)果與分析

2.1犬腹瀉病腸道細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

自5只病犬分離的細(xì)菌在NA、EMB、MAC、SS、BS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征及涂片染色鏡檢結(jié)果見(jiàn)表2。

將分離的菌株按常規(guī)方法分別接種于葡萄糖、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、硫化氫、靛基質(zhì)、乳糖、衛(wèi)矛醇、苯丙氨酸、尿素、氨對(duì)微量生化管中，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄生化反應(yīng)結(jié)果（表3）。

3結(jié)論與討論

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，在17種抗菌藥物中，沙門(mén)氏菌對(duì)新霉素、卡那霉素、妥布霉素、復(fù)方新諾明、慶大霉素5種藥物敏感，對(duì)多黏菌素B、四環(huán)素2種藥物中介，對(duì)其他10種藥物耐藥。大腸埃希菌對(duì)紅霉素、妥布霉素、復(fù)方新諾明3種藥物敏感，對(duì)卡那霉素、呋喃妥因、多黏菌素B、慶大霉素4種藥物中介，對(duì)其他10種藥物產(chǎn)生了耐藥性。犬沙門(mén)氏菌和大腸埃希菌產(chǎn)生廣泛的耐藥不敏感現(xiàn)象，可能與近幾年抗生素藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用有關(guān)，導(dǎo)致細(xì)菌遺傳性狀變異，產(chǎn)生耐藥質(zhì)粒。在疾病治療中，按規(guī)定劑量、規(guī)定方法和療程用藥，切勿亂用藥，這是避免耐藥菌株繼續(xù)增多的根本方法[8]。因此，在臨床選藥治療犬病時(shí)，應(yīng)根據(jù)病情結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選藥。根據(jù)本次細(xì)菌分離及藥敏試驗(yàn)結(jié)果在臨床治療常德地區(qū)大腸埃希菌和沙門(mén)氏桿菌引起的犬腹瀉病時(shí)，可首選妥布霉素藥、復(fù)方新諾明、卡那霉素、萘啶酸、慶大霉素、新霉素、紅霉素等對(duì)細(xì)菌敏感性高的藥物，以提高療效，降低細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性的產(chǎn)生。

參考文獻(xiàn)：

[1]王代賓，張艷麗，王立芬. 犬腹瀉病的危害及其診治[J]. 養(yǎng)殖技術(shù)顧問(wèn)，2011（10）：138-138.

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[8]朱忠珂，范國(guó)英，鐘華. 犬大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，8（16）：93-94.endprint

2結(jié)果與分析

2.1犬腹瀉病腸道細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

自5只病犬分離的細(xì)菌在NA、EMB、MAC、SS、BS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征及涂片染色鏡檢結(jié)果見(jiàn)表2。

將分離的菌株按常規(guī)方法分別接種于葡萄糖、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、硫化氫、靛基質(zhì)、乳糖、衛(wèi)矛醇、苯丙氨酸、尿素、氨對(duì)微量生化管中，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄生化反應(yīng)結(jié)果（表3）。

3結(jié)論與討論

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，在17種抗菌藥物中，沙門(mén)氏菌對(duì)新霉素、卡那霉素、妥布霉素、復(fù)方新諾明、慶大霉素5種藥物敏感，對(duì)多黏菌素B、四環(huán)素2種藥物中介，對(duì)其他10種藥物耐藥。大腸埃希菌對(duì)紅霉素、妥布霉素、復(fù)方新諾明3種藥物敏感，對(duì)卡那霉素、呋喃妥因、多黏菌素B、慶大霉素4種藥物中介，對(duì)其他10種藥物產(chǎn)生了耐藥性。犬沙門(mén)氏菌和大腸埃希菌產(chǎn)生廣泛的耐藥不敏感現(xiàn)象，可能與近幾年抗生素藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用有關(guān)，導(dǎo)致細(xì)菌遺傳性狀變異，產(chǎn)生耐藥質(zhì)粒。在疾病治療中，按規(guī)定劑量、規(guī)定方法和療程用藥，切勿亂用藥，這是避免耐藥菌株繼續(xù)增多的根本方法[8]。因此，在臨床選藥治療犬病時(shí)，應(yīng)根據(jù)病情結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選藥。根據(jù)本次細(xì)菌分離及藥敏試驗(yàn)結(jié)果在臨床治療常德地區(qū)大腸埃希菌和沙門(mén)氏桿菌引起的犬腹瀉病時(shí)，可首選妥布霉素藥、復(fù)方新諾明、卡那霉素、萘啶酸、慶大霉素、新霉素、紅霉素等對(duì)細(xì)菌敏感性高的藥物，以提高療效，降低細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性的產(chǎn)生。

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[8]朱忠珂，范國(guó)英，鐘華. 犬大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，8（16）：93-94.endprint

2結(jié)果與分析

2.1犬腹瀉病腸道細(xì)菌分離鑒定結(jié)果

自5只病犬分離的細(xì)菌在NA、EMB、MAC、SS、BS培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)特征及涂片染色鏡檢結(jié)果見(jiàn)表2。

將分離的菌株按常規(guī)方法分別接種于葡萄糖、賴氨酸、鳥(niǎo)氨酸、硫化氫、靛基質(zhì)、乳糖、衛(wèi)矛醇、苯丙氨酸、尿素、氨對(duì)微量生化管中，于37 ℃培養(yǎng)18～24 h，觀察并記錄生化反應(yīng)結(jié)果（表3）。

3結(jié)論與討論

藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明，在17種抗菌藥物中，沙門(mén)氏菌對(duì)新霉素、卡那霉素、妥布霉素、復(fù)方新諾明、慶大霉素5種藥物敏感，對(duì)多黏菌素B、四環(huán)素2種藥物中介，對(duì)其他10種藥物耐藥。大腸埃希菌對(duì)紅霉素、妥布霉素、復(fù)方新諾明3種藥物敏感，對(duì)卡那霉素、呋喃妥因、多黏菌素B、慶大霉素4種藥物中介，對(duì)其他10種藥物產(chǎn)生了耐藥性。犬沙門(mén)氏菌和大腸埃希菌產(chǎn)生廣泛的耐藥不敏感現(xiàn)象，可能與近幾年抗生素藥物在臨床上的廣泛應(yīng)用有關(guān)，導(dǎo)致細(xì)菌遺傳性狀變異，產(chǎn)生耐藥質(zhì)粒。在疾病治療中，按規(guī)定劑量、規(guī)定方法和療程用藥，切勿亂用藥，這是避免耐藥菌株繼續(xù)增多的根本方法[8]。因此，在臨床選藥治療犬病時(shí)，應(yīng)根據(jù)病情結(jié)合藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理選藥。根據(jù)本次細(xì)菌分離及藥敏試驗(yàn)結(jié)果在臨床治療常德地區(qū)大腸埃希菌和沙門(mén)氏桿菌引起的犬腹瀉病時(shí)，可首選妥布霉素藥、復(fù)方新諾明、卡那霉素、萘啶酸、慶大霉素、新霉素、紅霉素等對(duì)細(xì)菌敏感性高的藥物，以提高療效，降低細(xì)菌對(duì)抗生素耐藥性的產(chǎn)生。

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[8]朱忠珂，范國(guó)英，鐘華. 犬大腸桿菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī)，2012，8（16）：93-94.endprint