清熱排毒膠囊對急性痛風(fēng)大鼠模型IL-1β、IL-8和TNF-α的影響

王苗慧，馬鴻斌，孫紅旭，楊雪芳，常建全

（1.甘肅中醫(yī)學(xué)院2011級碩士研究生，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，甘肅 蘭州 730020）

痛風(fēng)（Gout）是由于嘌呤代謝紊亂和（或）尿酸排泄障礙所引起的血尿酸增高的代謝性疾病，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎（acute gouty arthritis）是其最常見的首發(fā)癥狀。近年來，研究認(rèn)為痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展過程與IL-1、IL-6、IL-8、TNF-α等細(xì)胞因子有關(guān)［1］。導(dǎo)師馬鴻斌教授臨床應(yīng)用清熱排毒膠囊治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎取得滿意效果。我們通過檢測急性痛風(fēng)模型大鼠踝關(guān)節(jié)浸出液中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-8和TNF-α的含量，探討清熱排毒膠囊防治急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的部分作用機(jī)理，總結(jié)如下。

1 實驗材料

實驗動物：健康SPF級SD雄性大鼠60只，體質(zhì)量（200±20）g，購自甘肅中醫(yī)學(xué)院SPF實驗中心，實驗動物質(zhì)量合格證號SCXK（甘）2011-0001-0001221。實驗期間大鼠自由攝食和飲水。

藥品與試劑：清熱排毒膠囊（土茯苓、秦艽、萆薢、薏苡仁、延胡索、沒藥、三七、黃芪等），由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院制劑科制成生藥膠囊，每粒0.45g，批號121022；雙氯芬酸鈉雙釋放腸溶膠囊（戴芬），TemmLer Werke GmbH生產(chǎn)，每片75mg，批號104166；尿酸鈉（MSU），SIGMA公司，每瓶5g，批號10010995；IL-1β、IL-8和TNF-α ELISA試劑盒，購自上海麗臣商貿(mào)有限公司，批號CK-E30419，CKE30583，CK-E30635。

實驗儀器：游標(biāo)卡尺（上海申韓量具有限公司），BP210S 電子分析天平（Sartorius公司提供），SHZ-82水浴恒溫振蕩器（金壇市恒豐儀器廠），10～500μL微量移液器（上海求精生化試劑儀器有限公司），酶聯(lián)免疫檢測儀（Benchmark Plus，美國BIO-RAD）。其余相關(guān)設(shè)備由甘肅中醫(yī)學(xué)院科研實驗中心提供。

2 實驗方法

分組與給藥：選用健康SPF級SD雄性大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，稱重，之后采用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為空白組、模型組、雙氯芬酸鈉緩釋片組（戴芬組）、清熱排毒膠囊高、中、低劑量組，每組10只。根據(jù)人與動物及各類動物間藥物劑量的換算方法，清熱排毒膠囊高、中、低劑量組的給藥劑量分別為1g/kg、0.5g/kg、0.25g/kg，戴芬組給藥劑量為6.8mg/kg，溶于蒸餾水配制成相應(yīng)濃度的灌胃藥液。空白組、模型組給予相應(yīng)體積的蒸餾水。灌胃按1mL/100g計算，以上各組每天灌胃給藥1次，連續(xù)給藥7天。

造模方法：取500mg尿酸鈉晶體（MSU）加入25mL 0.9%氯化鈉注射液，攪拌制成濃度為20mg/mL的尿酸鈉溶液。采用改良后的Coderre大鼠動物模型造模方法［2，3］。第5天灌胃給藥1h后，選受試大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)背側(cè)，常規(guī)碘伏消毒后，用6號注射針與脛骨成45℃方向插入踝關(guān)節(jié)，將100μL尿酸鈉溶液注入到踝關(guān)節(jié)腔，以關(guān)節(jié)囊對側(cè)鼓起為注入標(biāo)準(zhǔn)，即成大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型。空白組用等體積生理鹽水溶液關(guān)節(jié)腔注射。

取材方法：造模48h后將所有實驗動物用過量水合氯醛（350mg/kg）腹腔注射麻醉處死，剪取右側(cè)踝關(guān)節(jié)（關(guān)節(jié)近端及遠(yuǎn)端各保留約0.5cm），去皮，剪開關(guān)節(jié)周圍組織，將組織浸泡于盛有3mL生理鹽水的離心管中，恒溫震蕩10min后再浸泡1h，4℃低溫離心（12000rpm，10min），取上清液分裝于EP管中，-80℃低溫冰箱凍存待測相關(guān)指標(biāo)。

3 觀察方法

觀測指標(biāo)：觀察各組大鼠造模前后關(guān)節(jié)皮色、皮溫、腫脹等一般情況。大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度測定方法為實驗前在每只大鼠右側(cè)踝關(guān)節(jié)處用記號筆作一清晰標(biāo)記，通過2～3mm寬紙條和游標(biāo)卡尺測量造模前、后不同時間段的踝關(guān)節(jié)周徑，計算出踝關(guān)節(jié)腫脹度=（測定時間點關(guān)節(jié)周徑－初始周徑）/初始周徑。采用 ELISA 法檢測大鼠踝關(guān)節(jié)浸出液中IL-1β、IL-8和TNF-α的含量，具體操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

4 實驗結(jié)果

一般情況。各組大鼠造模前精神狀態(tài)佳、活潑好動，造模后大鼠右踝關(guān)節(jié)明顯紅腫、灼熱、倦怠懶動、攝食量明顯減少?？瞻捉M關(guān)節(jié)與造模前相比略增粗，無明顯紅腫及活動受限的表現(xiàn)。模型組關(guān)節(jié)紅腫、灼熱較藥物治療組明顯，說明各藥物治療組預(yù)防性給藥有效。

各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度見表1。

表1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度比較 （%，）

表1 各組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度比較 （%，）

注：與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與戴芬組比較，*P<0.05，**P<0.01。

組別 6h 8h 10h 12h 24h 48h空白組 0.133±0.033##** 0.126±0.032##** 0.112±0.032##** 0.103±0.029##** 0.083±0.020##** 0.043±0.007##**模型組 0.399±0.044** 0.500±0.019** 0.477±0.023** 0.439±0.043** 0.398±0.024** 0.350±0.021**戴芬組 0.260±0.036## 0.300±0.033## 0.274±0.034## 0.247±0.036## 0.207±0.030## 0.155±0.017##清熱排毒高劑量組 0.337±0.019##** 0.373±0.015##** 0.351±0.018##** 0.340±0.014##** 0.300±0.019##** 0.248±0.014##**清熱排毒中劑量組 0.330±0.027##** 0.358±0.018##** 0.345±0.025##** 0.327±0.017##** 0.290±0.020##** 0.231±0.017##**清熱排毒低劑量組 0.350±0.048##** 0.384±0.019##** 0.359±0.023##** 0.345±0.026##** 0.305±0.022##** 0.261±0.013##**

各組大鼠踝關(guān)節(jié)浸出液中IL-1β、IL-8和TNF-α含量見表2。

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)浸出液中IL-1β、IL-8和TNF-α含量 （pg/mL，）

表2 各組大鼠踝關(guān)節(jié)浸出液中IL-1β、IL-8和TNF-α含量 （pg/mL，）

注：與模型組比較，#P<0.05，##P<0.01；與戴芬組比較，*P<0.05，**P<0.01；與清熱排毒中劑量組比較，▲P<0.05，▲▲P<0.01。

組別 劑量 IL-1β IL-8 TNF-α空白組 - 3.88±0.36## 29.60±3.66## 3.10±0.51##模型組 - 4.90±0.46**▲ 37.90±4.76**▲ 4.25±0.46▲**戴芬組 6.8mg·kg-1 4.00±0.37## 31.44±2.54## 3.21±0.42##清熱排毒高劑量組 1g·kg-1 4.30±0.39## 33.20±2.48# 3.59±0.60##清熱排毒中劑量組 0.5g·kg-1 4.21±0.52## 32.67±3.65## 3.33±0.36##清熱排毒低劑量組 0.25mg·kg-1 4.44±0.50# 34.07±4.45# 3.73±0.56#*

5 討 論

急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī) “痹證”、“歷節(jié)病”、“白虎歷節(jié)”范疇。元代朱丹溪所著《格致余論·痛風(fēng)論》中明確提出痛風(fēng)的病機(jī)理論為“熱血得寒，污濁凝澀，所以作痛”，說明痛風(fēng)的發(fā)生是由于一種病理產(chǎn)物阻遏脈道，影響氣血正常運行，不通則痛。馬鴻斌教授認(rèn)為本病的發(fā)生多由先天正氣不足或勞倦過度，風(fēng)、寒、濕、熱之邪侵襲人體，痹阻關(guān)節(jié)經(jīng)絡(luò)，以致經(jīng)絡(luò)阻滯，氣血運行不暢而致。初起屬實證，多為濕熱痹阻、氣滯血瘀。清熱排毒膠囊有利濕清熱、活血消腫功效。方中萆薢性平味苦，能祛風(fēng)除濕、通絡(luò)止痛；土茯苓“利濕去熱，能入絡(luò)，搜剔濕熱之蘊(yùn)毒”（《本草正義》），用于肢體拘攣、關(guān)節(jié)不利等癥共為君藥。延胡索辛散溫通，為活血行氣止痛之良藥。沒藥活血化瘀止痛共為臣藥。使以三七味甘微苦性溫，活血化瘀而消腫定痛。秦艽、薏苡仁等加強(qiáng)清熱利濕之力。使以黃芪益氣健脾以防諸藥傷正。甘草調(diào)和諸藥。諸藥合用，共奏補(bǔ)肝腎、益氣血、利濕濁之功。實驗結(jié)果顯示，造模后大鼠踝關(guān)節(jié)明顯紅腫、灼熱、活動受限，造模48h后清熱排毒膠囊中劑量組大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度與戴芬組相當(dāng)，提示清熱排毒膠囊能夠降低急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠踝關(guān)節(jié)腫脹度，具有抗炎消腫的作用。

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎是體內(nèi)長期嘌呤代謝紊亂導(dǎo)致血尿酸升高，當(dāng)超過了尿酸溶解度，尿酸鈉微晶體即可沉積在關(guān)節(jié)滑膜及其周圍組織上，刺激關(guān)節(jié)滑膜，發(fā)生滑膜局部血管擴(kuò)張、通透性增加、白細(xì)胞聚集等炎癥反應(yīng)，進(jìn)而出現(xiàn)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎［4］。諸多研究表明，IL-1β、IL-8和TNF-α作為炎癥趨化因子和激活因子在痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用，認(rèn)為IL-1β、TNF-α是前炎癥網(wǎng)鏈中的一級細(xì)胞因子，而IL-8是由IL-1β、TNF-α誘導(dǎo)的二級前炎癥細(xì)胞因子［5］。用尿酸鈉誘導(dǎo)急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠模型48h后，模型組踝關(guān)節(jié)浸出液中IL-1β、IL-8和TNF-α均有較高水平的表達(dá)，表明這些炎性細(xì)胞因子參與了痛風(fēng)的發(fā)病過程。實驗研究顯示，清熱排毒膠囊中劑量組對大鼠急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎模型大鼠踝關(guān)節(jié)浸出液中IL-1β、IL-8和TNF-α的表達(dá)有明顯抑制作用，可達(dá)到與戴芬相似的炎癥抑制作用，由此推測清熱排毒膠囊對急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎具有一定的治療作用，其發(fā)揮抗炎作用機(jī)制可能與抑制滑膜組織中IL-1β、IL-8和TNF-α的表達(dá)有關(guān)，但其具體作用機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

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