酶聯(lián)免疫吸附法檢測乙肝表面抗原不同程度乳糜血對其的干擾分析*

張杰嫦，賴艷娥，劉運(yùn)保，鄧凱航，喻紅玲，林雪珍，虢 娟，謝冬梅，黃勇華，張松英，廖麗梅，龔嘉聰

清遠(yuǎn)市中心血站，廣東 清遠(yuǎn) 511518

血液是醫(yī)院救治患者生命的關(guān)鍵點(diǎn)，因此，嚴(yán)格管理血液安全和質(zhì)量對輸血安全的防控具有重大意義。隨著人們生活質(zhì)量的提升，以及人們不良的生活習(xí)慣出現(xiàn)，乳糜血在無償獻(xiàn)血者血液中出現(xiàn)的比例逐漸增多，在我國為了保證獻(xiàn)血者身體健康減少獻(xiàn)血不良反應(yīng)未對獻(xiàn)血者獻(xiàn)血前飲食情況加以限制，獻(xiàn)血者往往是餐后獻(xiàn)血，這就導(dǎo)致餐后乳糜微粒生理一過性增高，乳糜血中膽固醇、磷脂等物質(zhì)含量偏高，致使血漿呈現(xiàn)乳白色或混濁狀，進(jìn)而無法用于臨床輸血或血液品制作。因此乳糜血被淘汰比率逐年增高。臨床上，乳糜血會影響多項(xiàng)生化項(xiàng)目的檢測，而關(guān)于乳糜血漿對酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測的影響報(bào)道不多。本研究細(xì)化乳糜血漿的程度，于不同時間檢測乙肝表面抗原（HBsAg），研究不同乳糜程度對HBsAg 檢測結(jié)果的干擾，探討乳糜血漿檢測結(jié)果的可靠性，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

廣東省清遠(yuǎn)市中心血站于2018 年采集192 名無償獻(xiàn)血者血液，獻(xiàn)血者均符合國家衛(wèi)生部頒發(fā)的《獻(xiàn)血者健康檢查要求》（GB18467－2001），征得獻(xiàn)血者知情同意并簽署知情同意書。分離血漿，收集血漿192 袋，其中無乳糜血漿（乳糜指數(shù)為≤1）24袋，不同乳糜程度血漿168袋（乳糜指數(shù)2、3、4、5、6、8 及＞8 各24 袋）。無乳糜的乙肝表面抗原陽性血漿1 袋。所有實(shí)驗(yàn)用血漿均經(jīng)病毒滅活處理。

1.2 試劑與儀器

HBsAg 試劑（北京萬泰生物藥業(yè)股份有限公司，批號N20180721），SEPAMATIC-SL（III）全自動血液成分分離機(jī)（德國普特公司），BSSD-III-01 速凍機(jī)（武漢貝索公司），Xantus 150 全自動加樣系統(tǒng)（深圳愛康公司），BEPIII 全自動酶聯(lián)免疫分析系統(tǒng)（德國西門子公司），快速混勻器（江蘇新康公司），所有儀器經(jīng)廠家檢定合格，均在校準(zhǔn)期內(nèi)。乳糜測定儀：移動式乳糜測定儀（自主研發(fā)）等。

1.3 方法

向不同程度乳糜血漿加入等量的HBsAg 陽性血液，通過不同檢測時間，對不同乳糜指數(shù)血漿，采用ELISA 檢測HBsAg。操作按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

1.3.1 樣本處理 從收集到的不同乳糜程度的192 袋乳糜血漿中準(zhǔn)確吸取2 mL 血漿，加入2 mL HBsAg 陽性血清（S/CO=11.524），用混勻器充分混勻后作為測定管。

1.3.2 血漿乳糜指數(shù)確定 加入HBsAg 陽性血漿后造成原血漿乳糜程度變化，取1 mL 的混勻血漿按血液乳糜程度檢測方法重新確定血漿乳糜指數(shù)。

1.3.3 離心血漿HBsAg 檢測 混勻血漿經(jīng)1 000～1 498 g離心20 min后，分層清晰，取無或少乳糜層的中下層血漿檢測HBsAg。

1.3.4 在不同時間檢測HBsAg 選取乳糜指數(shù)分別為≤1、2、4、5、6、8 及＞8 血漿各20 份，放置4℃冰箱，分別于第3 d、第5 d、第7 d、第10 d檢測HBsAg。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，計(jì)算均數(shù)的變異系數(shù)CV，組間比較采用t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同程度乳糜血漿HBsAg檢測結(jié)果

分別對不同程度乳糜指數(shù)≤1、2、3、4、5、6、8 及＞8血漿樣本檢測HBsAg，根據(jù)A值，計(jì)算X =S/CO，結(jié)果顯示：單個樣本之間的A 值差異大，應(yīng)與乳糜血漿中的乙肝表面抗體含量高低有關(guān)，乳糜指數(shù)2 以上的血漿與無乳糜血漿之間比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），重度乳糜血漿比無乳糜血漿S/CO 值稍高，見表1。

表1 不同乳糜程度血漿HBsAg檢測結(jié)果

2.2 不同時間檢測乳糜血漿HBsA結(jié)果分析

乳糜指數(shù)分別為≤1、2、3、4、5、6、8 及＞8 血漿各20 份，放置4 ℃冰箱，分別于首次檢測后的第3 d、第5 d、第7 d、第10 d，檢測HBsAg。不同程度乳糜血漿放置不同時間，HBsAg檢測結(jié)果有區(qū)別，乳糜指數(shù)≤3的乳糜血漿10 d 內(nèi)檢測差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；乳糜指數(shù)4、5、6、8 及>8 的乳糜血漿第3 d 及以后與第1 d 的檢測結(jié)果差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表2。

表2 不同時間檢測乳糜血漿HBsA結(jié)果分析（±s）

表2 不同時間檢測乳糜血漿HBsA結(jié)果分析（±s）

乳糜指數(shù)≤1時間（d）t值1 5.919±1.244 5.347±0.924 5.351±1.005 5.356±1.352 5.946±0.945 6.804±0.768 6.618±0.595 6.782±0.875 3 5 7 t1，3 t1，5 t1，7 t1，10 2 3 4 5 6 8 ＞8 5.963±2.043 5.051±1.724 5.054±1.199 4.397±1.392 4.113±1.398 5.215±0.701 5.637±1.218 5.651±1.385 6.437±1.956 5.182±2.169 4.986±1.486 4.363±1.471 4.212±1.657 5.284±1.297 5.617±1.512 5.860±1.844 4.784±1.684 3.670±1.771 3.674±1.445 2.998±1.196 2.890±1.273 3.743±1.294 4.273±1.400 3.899±1.682 10 5.655±2.239 4.201±2.323 3.996±1.648 3.382±1.531 3.251±1.582 4.491±1.513 4.817±1.640 5.274±1.889 0.067 1.016 1.446 3.107 3.815 3.297 2.952 4.592 0.854 0.383 1.438 2.982 2.901 4.848 2.512 2.461 2.08 5.069 6.289 6.704 7.034 9.097 6.072 6.305 0.386 2.405 4.390 4.834 4.984 5.940 3.998 3.664

3 討論

血液檢測結(jié)果受諸多因素的影響，獻(xiàn)血人群、獻(xiàn)血前篩查、血液檢測實(shí)驗(yàn)室的質(zhì)量水平都可能對檢測結(jié)果造成影響。ELISA 檢測主要通過三聯(lián)吡啶釕與蛋白質(zhì)、半抗原激素、核酸等化合物進(jìn)行結(jié)合，其免疫檢驗(yàn)期間不受外來光源干擾，消除了光散射、噪音干擾，是HBV標(biāo)志物的檢驗(yàn)金標(biāo)準(zhǔn)[1]，但HBV 感染窗口期等會對其檢測結(jié)果造成干擾，增加漏診風(fēng)險(xiǎn)[2]。隨著酶免法檢測技術(shù)不斷完善，ELISA 也是醫(yī)院臨床及血液中心，中心血站常用免疫學(xué)檢測技術(shù)，它具有靈敏、 簡便、快速、載體易標(biāo)準(zhǔn)化等多種優(yōu)點(diǎn)，在血液篩查中應(yīng)用廣泛[3]，其在血HBsAg、抗HCV、抗HIV 和梅毒抗體檢測中發(fā)揮著重要的作用。無償獻(xiàn)血是自愿者將血液無私奉獻(xiàn)的一種大愛行為，在挽救患者人生命醫(yī)療救治工作中起到重要意義，為應(yīng)急事件用血需求和安全提供重要保障[4]。血液報(bào)廢不僅是一種浪費(fèi)，也是對獻(xiàn)血者獻(xiàn)血動力的打擊。街頭無償獻(xiàn)血人群具有較高乳糜血發(fā)生率，且乳糜血發(fā)生與獻(xiàn)血者性別、年齡、BMI、職業(yè)、獻(xiàn)血時間及獻(xiàn)血次數(shù)等有關(guān)，應(yīng)加強(qiáng)對乳糜血高發(fā)人群獻(xiàn)血知識宣教工作[5]。單位團(tuán)體獻(xiàn)血的不合格率最低（3.60%）、街頭個人獻(xiàn)血最高（4.91%），其他兄弟血站也有類似報(bào)道[6]，及時發(fā)現(xiàn)不符合獻(xiàn)血要求的獻(xiàn)血者，建議延期獻(xiàn)血避免血液浪費(fèi)，加大無償獻(xiàn)血宣傳力度，針對性地加強(qiáng)不同性別、年齡、體重的無償獻(xiàn)血者的宣傳教育，讓獻(xiàn)血者了解獻(xiàn)血前進(jìn)食高蛋白飲食（如動物脂肪、牛奶、雞蛋、豆制品），對血液安全及質(zhì)量的影響。對獻(xiàn)血工作者從源頭抓起，避免乳糜血的采集。調(diào)查顯示1 010 名無償獻(xiàn)血者其中146 例為不同程度乳糜血，占總?cè)藬?shù)的14.5%，因中重度乳糜而被淘汰人數(shù)占4.8%[7]。乳糜血內(nèi)含有較多量的微小顆粒，在輸注時可能引起微血管堵塞。另外，乳糜血標(biāo)本會直接或間接影響血液檢測結(jié)果[8]，如果輸注重度乳糜血，里面的乳糜微?？赡芤鹗苎呶⒀艿闹舅ㄈ?，或者過敏發(fā)熱等輸血不良反應(yīng)，也會使血液檢查結(jié)果偏離[9]。乳糜血漿與無乳糜血漿之間的S/CO 值比較無顯著差異，重度乳糜血漿比無乳糜血漿S/CO 值稍高，分析檢測結(jié)果偏高的原因，乳糜血漿中的脂溶性CM 附著在ELISA 試劑聚苯乙烯板孔表面，影響了洗板效果，增加游離酶標(biāo)記物質(zhì)的殘留量，導(dǎo)致乳糜血相應(yīng)的S/CO 值偏高[10]。查看相關(guān)文獻(xiàn)，有關(guān)乳糜血漿對ELISA 法的影響眾說不一[11-12]。根據(jù)項(xiàng)目結(jié)果統(tǒng)計(jì)可知，不同程度乳糜血漿對HBsAg檢測無影響，這與夏兵的報(bào)道是一致的[13]，一項(xiàng)研究采用分離乳糜血漿組與原血漿組的比較，其中一種試劑無顯著差異[14]，也可說與本文結(jié)果相一致的。一項(xiàng)研究用高速離心法對比重度脂標(biāo)本對ELISA 的影響，結(jié)論是高速離心前后無顯著性差異[15]。在實(shí)際工作中，因加樣器的設(shè)計(jì)是探測液面即吸樣，如遇到明顯分層的乳糜血漿，為了保證檢測結(jié)果的可靠性，必須先手工分離乳糜層。應(yīng)用濾器過濾法和高速離心法可以有效處理去除脂肪血漿中的乳糜微粒，4 ℃倒置冷藏法處理脂肪血漿能力有限，脂肪血漿經(jīng)適當(dāng)處理后可以提高其質(zhì)控達(dá)標(biāo)符合率[16]，消除脂血的最佳方式為高速離心法，能夠有效提升生化檢驗(yàn)準(zhǔn)確性，為臨床診斷及治療方案的制定提供更加精準(zhǔn)的參照指標(biāo)[17]。

乳糜指數(shù)2 及以上的乳糜血漿在第7 d 的檢測結(jié)果與第1 d 比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，增加室溫放置時間能增高A值，從而增大S/CO 值，分析其原因，有可能隨著反應(yīng)時間的增長，增加了微孔包被的HBsAb與血漿中HBsAg的結(jié)合反應(yīng)。檢測過程的改變會導(dǎo)致的檢測結(jié)果變化，在同等條件下，乳糜血漿與無乳糜血漿相比較，乳糜血漿受影響更明顯。乳糜指數(shù)2 和3 的乳糜血漿10 d 內(nèi)檢測無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，第10 d 與第1 d 的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；乳糜指數(shù)4、5、6、8及＞8的乳糜血漿在第3 d的檢測結(jié)果與第1 d比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不同乳糜程度血漿放置時間不同，TP-Ab 檢測結(jié)果有差異：放置時間延長，檢測結(jié)果升高[18]。因此聯(lián)想到實(shí)際工作中，標(biāo)本檢測一般都會在3 d內(nèi)完成，但復(fù)查標(biāo)本因各種原因有可能3 d 內(nèi)沒完成的，以后工作中對于中度、重度乳糜血漿必須在3 d 內(nèi)完成檢測，以保證血液檢測的質(zhì)量。這與劉運(yùn)保[19]的研究觀點(diǎn)基本相符合。綜上所述，血液中心及血站等采供血機(jī)構(gòu)必須加強(qiáng)無償獻(xiàn)血宣傳力度，讓獻(xiàn)血者了解獻(xiàn)血前后注意事項(xiàng)，有針對性地對存在危險(xiǎn)因素群體進(jìn)行初篩及征詢，避免不合格血液的采集，保障血液安全的基礎(chǔ)上避免血液的浪費(fèi)，降低乳糜血報(bào)廢率，精益求精保證血液安全質(zhì)量。