不同條件對(duì)黑曲霉2產(chǎn)纖維素酶活性的影響

王 幸，陳穎妃，林煜丹，何禮安，關(guān)洪威，肖相政

（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，廣東 廣州 510225）

隨著經(jīng)濟(jì)和社會(huì)的發(fā)展，固體有機(jī)廢物產(chǎn)生量不斷增長(zhǎng)，據(jù)資料統(tǒng)計(jì)，2009年規(guī)?；B(yǎng)殖畜禽糞便產(chǎn)量約為8.37億噸［1］，2010年我國(guó)農(nóng)作物秸稈產(chǎn)量達(dá)7.3億噸［2］，上述廢棄物的隨意排放和不合理處置對(duì)環(huán)境造成巨大壓力，亟待解決。農(nóng)作物秸稈、畜禽糞便等有機(jī)廢棄物除含有大量的纖維素外，還含有氮、磷、鉀及多種微量元素［3］，因此通過(guò)科學(xué)處理和特殊工藝可將其變廢為寶，進(jìn)行循環(huán)利用。目前比較成熟的降解纖維類廢棄物的方法是好氧生物處理，利用好氧微生物在有氧條件下纖維素酶的代謝作用，將廢物中復(fù)雜的有機(jī)物分解，進(jìn)一步將其加工成飼料、有機(jī)肥料等［4－5］。目前用于生產(chǎn)纖維素酶的微生物大多為絲狀真菌，研究較多的有木霉屬、曲霉屬、根霉屬和漆斑霉屬，其中曲霉是公認(rèn)產(chǎn)纖維素酶最高的菌種之一［6］。黑曲霉2是仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院自行分離篩選的一株具有產(chǎn)纖維素酶活性的絲狀真菌，研究表明，該菌對(duì)木薯渣、煙葉渣、園林廢棄物等具有較好的降解效果，應(yīng)用潛力巨大。為進(jìn)一步提高其產(chǎn)酶效率，本文研究了培養(yǎng)時(shí)間、接種菌齡、裝液量（通氣）、初始pH、底物碳源等條件對(duì)產(chǎn)纖維素酶活性的影響，以期為今后推廣應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株 黑曲霉2（仲愷農(nóng)業(yè)工程學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院保存），以冰箱保存原始菌株為母種，由母種經(jīng)復(fù)壯活化轉(zhuǎn)接的為一代菌種，依此分別為二代、三代菌種。

1.1.2 產(chǎn)酶基礎(chǔ)培養(yǎng)基 蔗糖30g，硝酸鈉2g，磷酸二氫鉀1g，氯化鉀0.5g，七水硫酸鎂0.5g，七水硫酸亞鐵0.01g，水1000mL，自然pH，121℃滅菌30min。

1.1.3 主要試劑 磷酸鈉緩沖液（（0.2mol/L，pH6.0）、羧甲基纖維素鈉鹽（CMC）緩沖液、3，5－二硝基水楊酸（DNS）顯色劑、1000μg/mL標(biāo)準(zhǔn)葡萄糖溶液、標(biāo)準(zhǔn)纖維素酶液（廣州某化學(xué)試劑店購(gòu)買）。

1.1.4 底物碳源 木薯渣、稻秸、糖泥、中藥渣（其中木薯渣、糖泥分別取自廣東某淀粉廠和糖廠，中藥渣取自廣州某制藥公司，木薯渣、稻秸、糖泥、中藥渣經(jīng)60℃烘干后磨碎，過(guò)60目篩備用）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 纖維素酶活性測(cè)定 纖維素粗酶液制備：發(fā)酵液經(jīng)5000r/m離心10min，上清液即為粗酶液。纖維素酶活性測(cè)定：參照農(nóng)用微生物菌劑（GB20287－2006）中纖維素酶活性測(cè)定方法［7］，以羧甲基纖維素鈉鹽作底物，CMC經(jīng)纖維素酶水解后生成還原糖，還原糖能與3，5－二硝基水楊酸作用使硝基還原為氨基，溶液變?yōu)槌壬壬纳疃扰c還原糖濃度成正比，因此通過(guò)比色可求得還原糖含量，進(jìn)而可計(jì)算纖維素酶活性。酶活單位：在試驗(yàn)條件下，以每分鐘產(chǎn)生1μmol葡萄糖定義為1個(gè)酶活力單位［8］。

1.2.2 黑曲霉2種子液制備 將冰箱保存的黑曲霉2置于28℃的生化培養(yǎng)箱活化2h，然后轉(zhuǎn)接于50mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)24h，備用。

1.2.3 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑曲霉2產(chǎn)酶活性的影響 接種5mL黑曲霉2種子液于150mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)，分別于24h、48h、72h、96h測(cè)定纖維素酶活性。

1.2.4 接種菌齡對(duì)黑曲霉2產(chǎn)酶活性的影響 參照1.2.2方法，分別以母種、一代菌種、二代菌種、三代菌種制備種子液，然后接種5mL種子液于150mL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，48h測(cè)定各處理纖維素酶活性。

1.2.5 通氣量（裝液量）對(duì)黑曲霉2產(chǎn)酶活性的影響 以3%接種量分別轉(zhuǎn)接種子液于100mL、150mL、200mL、250mL的基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)，測(cè)定各處理48h的纖維素酶活性。

1.2.6 pH 對(duì)黑曲霉2產(chǎn)酶活性的影響 分別配制pH 值為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，然后接種5mL種子液，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)，48h測(cè)定各處理纖維素酶活性。

1.2.7 不同底物（碳源）對(duì)黑曲霉2產(chǎn)酶活性的影響 分別以中藥渣、木薯渣、水稻秸稈、糖泥為碳源替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖，接種5mL種子液于150mL各培養(yǎng)基中，30℃、200r/min搖床培養(yǎng)，48h測(cè)定各處理的纖維素酶活性。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文數(shù)據(jù)采用SAS9.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析（SAS Institute，Gary，NC，USA）；圖表制作采用軟件EXCEL 2003（Microsoft Company，USA）

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑曲霉2產(chǎn)纖維素酶活性的影響

分別在培養(yǎng)24、48、72、96h取樣測(cè)定發(fā)酵液纖維素酶活性，結(jié)果見圖1。

圖1 培養(yǎng)時(shí)間對(duì)黑曲霉2產(chǎn)纖維素酶活性的影響

從圖1中可以看到，黑曲霉2產(chǎn)纖維素酶具有一定的規(guī)律性，酶活隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而增加，48h達(dá)到活性高峰，酶活力為938.19μg/mL，隨后逐漸降低，至96h下降到45.57μg/mL。試驗(yàn)結(jié)果表明48h為黑曲霉2產(chǎn)酶活性高峰，此時(shí)菌體生長(zhǎng)旺盛。

2.2 接種菌齡對(duì)黑曲霉2產(chǎn)纖維素酶活性的影響

接種物菌齡直接影響菌體的生長(zhǎng)活性，菌齡越老，菌體活性一般較低。本研究中分別接種母種、一代、二代和三代菌種，并離心測(cè)定了菌體濕重，結(jié)果見表1。從表中結(jié)果可以看到，接種不同菌種影響產(chǎn)酶活性，其總體呈現(xiàn)出隨菌齡老化而降低的趨勢(shì)，接種二代菌種和三代菌種酶活力差別不大，以接種原始菌株產(chǎn)酶活性最高，48h達(dá)611.07μg/mL，同時(shí)測(cè)定的菌絲濕重和酶活性具有一定的相關(guān)性，酶活性越高，菌體濕重一般越大。

表1 接種物菌齡對(duì)黑曲霉2產(chǎn)纖維素酶活性的影響

2.3 通氣量對(duì)黑曲霉2產(chǎn)纖維素酶活性的影響

不同裝量對(duì)纖維素酶活性的影響見表2。從表中可知，不同裝液量對(duì)纖維素酶活性影響顯著，其中以裝量150、200mL時(shí)酶活性較高，相比100、250mL裝量時(shí)差異顯著，說(shuō)明黑曲霉2產(chǎn)酶需要一定的通氣條件，但并非通氣量越大越好，同時(shí)菌絲濕重與酶活性表現(xiàn)出較好相關(guān)性。

表2 不同裝液量對(duì)黑曲霉2產(chǎn)纖維素酶活性的影響

2.4 培養(yǎng)基初始pH對(duì)黑曲霉2產(chǎn)纖維素酶活性的影響

pH不但影響酶產(chǎn)量，而且影響酶的活性和穩(wěn)定性。分別調(diào)節(jié)基礎(chǔ)培養(yǎng)基pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，測(cè)定發(fā)酵液48h的纖維素酶活性，結(jié)果見圖2。從圖中可以看到，黑曲霉2在pH6.5時(shí)產(chǎn)酶活性最高，達(dá)787.46μg/mL，隨著pH增大，纖維素酶活性急劇下降，說(shuō)明黑曲霉2在中性偏酸的環(huán)境條件下生長(zhǎng)好，代謝旺盛，產(chǎn)酶量大，與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)的黑曲霉適宜生長(zhǎng)環(huán)境是弱酸性一致［9－10］。

圖2 初始pH對(duì)黑曲霉2產(chǎn)纖維素酶活性的影響

2.5 不同底物對(duì)黑曲霉2產(chǎn)纖維素酶活性的影響

分別采用木薯渣、水稻秸稈、糖泥、中藥渣作為碳源替代基礎(chǔ)培養(yǎng)中的蔗糖，測(cè)定48h的產(chǎn)酶活性，結(jié)果見表3。表中數(shù)據(jù)表明，纖維素酶活性因底物不同而有差異，其中以木薯渣做底物時(shí)，活性最高，達(dá)761.95μg/mL，其次為中藥渣，而以稻秸、糖泥做底物時(shí)，產(chǎn)酶活性相對(duì)較差，說(shuō)明在四種有機(jī)廢棄物中，黑曲霉2對(duì)木薯渣的分解能力最強(qiáng)，效果最好。同時(shí)從測(cè)定的菌體濕重也可看到，其量與酶活性成正比，顯示了較好的相關(guān)性。

表3 不同底物對(duì)黑曲霉2產(chǎn)酶活性的影響

3 結(jié)論與討論

本文系統(tǒng)研究了接種菌齡、培養(yǎng)時(shí)間、通氣量、初始pH和不同碳源底物對(duì)黑曲霉2產(chǎn)纖維素酶活性的影響，確定了黑曲霉2高效產(chǎn)酶的最佳培養(yǎng)條件，即采用原始菌株接種、基礎(chǔ)培養(yǎng)基初始pH為6.5、每500mL搖瓶裝量為150mL、培養(yǎng)48h條件下產(chǎn)纖維素酶活性最高，為今后工業(yè)生產(chǎn)及高效應(yīng)用提供了技術(shù)參數(shù)。

纖維素酶是誘導(dǎo)酶，在纖維素酶的生產(chǎn)中選擇合適產(chǎn)酶誘導(dǎo)物十分重要。據(jù)資料報(bào)道，產(chǎn)酶誘導(dǎo)物效力最強(qiáng)的是槐糖［11］，但其價(jià)格昂貴，不適合工業(yè)生產(chǎn)。本研究中選擇了四種有機(jī)廢棄物做為產(chǎn)酶誘導(dǎo)底物和碳源，其表現(xiàn)出了不同的產(chǎn)酶效果，以木薯渣效果最好，表明黑曲霉2對(duì)木薯渣的利用能力最強(qiáng)，適合木薯渣的高效降解。本研究中酶活力測(cè)定采用的是液體發(fā)酵培養(yǎng)，但目前有機(jī)廢棄物常用的處理方法是生物堆肥，因此下一步擬對(duì)該菌固體發(fā)酵產(chǎn)酶條件進(jìn)行研究，以滿足生產(chǎn)的需要。

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